找回密码
 注册
搜索
热搜: 超星 读书 找书
查看: 1223|回复: 4

基础生物化学

[复制链接]
发表于 2004-12-23 23:25:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
我们所处在的地球充满着无数的生物,从最简单的病毒、类病毒到菌、藻、树、草,从鱼虫鸟兽到最复杂的人类,处处都可以发现它们的踪迹,觉察到生命的活动。地球上的生物形形色色,千姿百态。不同的生物,其形态、生理特征和对环境的适应能力各不相同,都经历着生长、发育、衰老、死亡的变化,都具有繁殖后代的能力。

1.1生物化学的概念和研究内容
生物化学可以认为是生命的化学,主要是应用化学的理论和方法研究微生物、植物、动物及人体等的化学组成、生命物质各组分的结构和性质、及它们在生命过程中的变化规律的一门科学。
生物化学的基本内容包括:
发现和阐明构成生命物体的分子基础生物分子的化学组成、结构和性质;
生物分子的结构、功能与生命现象的关系;
生物分子在生物机体中的相互作用及其变化规律(物质代谢、能量代谢、信息代谢)。
1.1.1生命的定义
生命的根本特性是什么?千百年来,人们以许多不同的观点阐述自己对此的看法。
19世纪下半叶时,恩格斯给生命下了一个定义:“生命是蛋白体的存在方式,这个存在方式的基本因素在于和它周围的外部自然界的不断地新陈代谢,而且这种新陈代谢一停止,生命就随之停止,结果便是蛋白质的分解。”恩格斯的生命定义在一定程度上揭示了生命的物质基础,即具有新陈代谢功能的蛋白体。100年来,这个定义一直指导人们认识生命的思想武器。
生命是一个很难下定义
(1)生理学定义 例如把生命定义为具有进食、代谢、排泄、呼吸、运动、生长、生殖等功能的系统。但某些细菌却不呼吸。
(2)新陈代谢定义 生命系统具有界面,与外界经常交换物质但不改变其自身性质。
(3)生物化学定义 生命系统包含储藏遗传信息的核酸和调节代谢的酶蛋白。但是已知某种病毒生物却无核酸(阮病毒)。
(4)遗传学定义 通过基因复制、突变和自然选择而进化的系统。
(5)热力学定义 生命是个开放系统,它通过能量流动和物质循环而不断增加内部质量。
Horowitz 观点
具有复制的能力
具有催化的能力
具有突变的能力
1.1.2 生命的构成
19世纪30年代,德国植物学家施莱登首先指出,所有植物体都是由细胞构成的。他的这个观点被德国动物学家施旺在动物组织和细胞研究中证实,所有动物也是由细胞构成的。
施旺指出:“细胞是有机体,整个动物或植物体乃是细胞的集合体。它们依照一定的规律排列在动物体内。”在此基础上他们创立了细胞学说。
细胞是生物体的基本结构单元
细胞是组成生物体的基本结构单元,是生物体进行代谢、能量转换、遗传以及其它生理活动的基本场所。
恩格斯把细胞学说、能量守恒和转换定律、达尔文进化论一起誉之为19世纪自然科学的三大发现。
由于细胞的发现,我们不仅知道一切高等有机体都是按照一个共同规律发育和生长的,而且通过细胞的变异,能改变自己,向更高的发育道路迈进。
1.1.3  细胞的分类和结构
所有的生物都是由细胞组成的,只是不同的生物体细胞的大小和形状有所不同。
有的细胞人的眼睛可以看得见,如鸟类的蛋,最大的直径近10厘米(鸵鸟蛋)。
有的细胞直径只有0.1微米,要用高倍显微镜才能看到,如原始的细菌。大多数细胞的直径是10-100微米,用低倍显微镜就能看到。
细胞的大小,即使在同一生物体的相同组织中也不一样。同一个细胞,处在不同发育阶段,它的大小也是会改变的。
细胞的分类
根据生物的进化程度,细胞可以分为两大类:

   原核细胞(Prokaryote cell)   
   真核细胞(Eukaryote cell)。
(1)原核细胞
原核细胞是一类进化程度低,结构最简单的一类细胞。属于原核细胞的有细菌(Bacteria)和蓝藻(blue-green algae)等。

原核细胞的特点
原核细胞的外层是细胞壁和细胞膜(质膜),内部为细胞质。细胞质的结构非常简单,没有明显的细胞器(由封闭的生物膜包裹的固体质粒),只有原始的细胞核(无核膜和核仁)和其它一些核糖核蛋白体等。
某 些 原 核 细 胞 的 形状
(2)真核细胞
真核细胞是高等植物和动物的基本组织单位。
真核细胞的外层为细胞膜(植物细胞还有一层细胞壁),内部为细胞质。
真核细胞的结构
细胞的三维结构图形
真核细胞的结构
细胞质的结构非常复杂,含有许多细胞器,主要有:细胞核、线粒体、核糖核蛋白体、高尔基体和溶酶体等。
植物细胞中还含有质体、叶绿体和液泡等。
各个细胞器具有不同的生物功能,它们之间的协调运作,使细胞内的代谢和各种生理活动能够有条不紊地进行。

1.2生物体的化学组成
自然界所有的生命物体都由三类物质组成水、无机离子和生物分子
生命体的元素组成
组成生命体的物质是极其复杂的。但在地球上存在的92种天然元素中,只有以下元素在生物体内被发现
第一类元素:包括C、H、O和N四种元素,是组成生命体最基本的元素。这四种元素约占了生物体总质量的99%以上。
第二类元素:包括S、P、Cl、Ca、K、Na和Mg。这类元素也是组成生命体的基本元素。
第三类元素:包括Fe、Cu、Co、Mn和Zn。是生物体内存在的主要少量元素。
第四类元素:包括Al、As、B、Br、Cr、F、Ga、I、Mo、Se、Si等。
生物分子
生物分子是生物体和生命现象的结构基础和功能基础,是生物化学研究的基本对象。
生物分子的主要类型包括:
  糖、脂、核酸和蛋白质等生物大分子
  及维生素、辅酶、激素、核苷酸和氨基酸等有机小分子。
生物化学的概念
生物化学主要是应用化学的理论和方法来研究生命现象,阐明生命现象的化学本质。
生物化学的基本内容包括:
  发现和阐明构成生命物体的分子基础生物分子的化学组成、结构和性质;
  生物分子的结构、功能与生命现象的关系;
  生物分子在生物机体中的相互作用及其变化规律。
1.3   生物化学的发展
  生物化学作为一门独立的自然科学,只有近200年的历史。但是其发展非常迅速,目前已成为自然科学领域发展最快、最引人注目的学科之一。
1.3.1 我国古代劳动人民的贡献
制饴、酿酒、制醋、制酱技术;掌握生产豆腐的工艺(贾思勰的《齐民要术》; 《齐民要术》是我国最早的一部完整的古农书。
对脚气病(多发性神经炎)和甲状腺肿的认识与治疗。
《本草纲目》(李时珍)


1.3.2  近代生物化学的发展
萌芽时期(18世纪下半叶—19世纪初):
静态生物化学阶段
 Scheele:瑞典化学家,分离得到甘油、柠檬酸、苹果酸、乳酸、尿酸、酒石酸等。
 Lavosier:法国化学家,1.首次证明动物的呼吸需要氧气;2. 同时证明燃烧过程是物质与氧的结合过程。
 Liebig:德国化学家,是农业化学的奠基人,也是生物化学和碳水化合物化学的创始人之一。首次提出新陈代谢这个学术名词。发现了马尿酸、氯仿。
 Wohler:与Liebig在同一个实验室,1828年在实验室合成了尿素。从而推翻了有机化合物只有在生物体内部合成的错误认识。
 从此生物体内糖类、脂类及氨基酸等均被详尽的研究。
 Ernst Felix Hoppe-Seyler:德国医生,1877年提出“Biochemie”即英文的““Biochemistry”.(Miescher是他的学生)


1.3.2  近代生物化学的发展
奠基时期(19世纪—20世纪):
动态生物化学阶段:科学家对生物物质代谢、平衡等进行了广泛深入的研究,基本阐明了酶的化学本质以及与能量代谢有关的物质代谢途径。
Summer:美国科学家,1926年得到脲酶的结晶,证明了酶的化学本质是蛋白质。
Embden:德国生物化学家,在糖代谢、脂代谢及肝脏合成氨基酸方面做出了巨大贡献,与他人一起证明了糖酵解途径。
Krebs:英国人,发现了尿素循环和三羧酸循环。
Calvin:美国人,发现了光合碳代谢途径。光合磷酸化过程。
Abel:1902年分离得到肾上腺素并制成结晶。
Went:1926年从燕麦胚芽鞘中分离出生长素。
Hopkins:英国剑桥生物化学中心,1912年前后发现维生素。



1.3.2  近代生物化学的发展
大发展时期(1930-至今):
机能生物化学阶段:科学家对生物的研究已从整体水平逐步深入到细胞、亚细胞、分子水平。伴随实验手段、技术的不断改进,使的对生物大分子结构及功能的研究也更加深入。
1.糖酵解、三羧酸循环、脂代谢、氧化磷酸化等生化反应过程均被阐述。
2.Watson,Crick首次描绘了DNA双螺旋结构模型,使人们第一次获知基因结构的实质。
3.英国物理学家Perutz用X-射线衍射技术,解析了血红蛋白的三维空间结构;Kendrew测定了肌红蛋白的结构。英国化学家Sanger利用10年时间完成牛胰岛素的结构测定。
4.美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中和大分子相互作用中的重要性;还研究了镰刀型红细胞贫血病,提出分子病的名称。


1.3.3  我国科学家在近代生物化学发展史中的贡献
1919-1922,吴宪提出用比色法测定血糖;
1924-1942,吴宪提出蛋白质变性学说。
汤佩松、殷宏章等在呼吸代谢、酶作用机理等方面作出突出的贡献。
1965年,人工合成具有生物学活性的牛胰岛素;1973年,测定了猪胰岛素的空间结构;1983年,完成酵母丙氨酸tRNA的人工合成。
植物收缩蛋白的研究(阎隆飞等)
生物膜结构与功能研究(杨福愉、黄芬等)
蛋白质合成后的转运(信号肽、分子伴侣)



1.5  生物化学知识的应用
工业方面:食品工业、化妆品工业、发酵工业、  制革工业、国防工业、环保工业等。

农业方面:优质、高产品种培育、优良品种鉴定、生物肥料、生物农药等。

医药业: 疾病诊治、生化制药、基因治疗等。

生物技术:基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。

近代生物化学的发展
   
                                                  
       植物生化   动物生化   微生物生化  病理生化

        农业生化     生物化学分支      食品生化
           
    无机生化  有机生化  生理生化  临床生化

生物工程  基因工程  发酵工程  蛋白质工程  酶工程
    教材安排与学习方法
回复

使用道具 举报

 楼主| 发表于 2004-12-23 23:27:51 | 显示全部楼层
第2章蛋白质
第一节  蛋白质的基本结构单位—氨基酸          (amino acid)


一、蛋白质的水解
二、氨基酸的分类
三、氨基酸的理化性质
四、氨基酸的分析分离(后讲)
一、蛋白质的水解
蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解,酸或碱能够将多肽完全水解,酶水解一般是部分水解.

完全水解得到各种氨基酸的混合物,部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。
所以,氨基酸是蛋白质的基本结构单元。
大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。

1、酸水解
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解,反应时间约20小时。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化,得到的是L-氨基酸。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏;
含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解;天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。
2、碱水解
一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。
由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏,产率不高。
部分的水解产物发生消旋化,其产物是D-型和L-型氨基酸的混合物。
该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
3、酶水解
目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)或称蛋白酶(proteinase)已有十多种。
应用酶水解多肽不会破坏氨基酸,也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。  
最常见的蛋白水解酶有以下几种:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。
二、氨基酸的分类
(一)根据来源分:内源氨基酸和外源氨基酸
(二)从营养学角度分:必需氨基酸和非必需氨基酸



  1、蛋白质中常见氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
氨基酸的结构
      
  按R基极性分类20种常见氨基酸
(1)非极性R基团氨基酸:8种—Ala Val Leu Ile      Phe Pro Met Trp(表1-2)
(2)极性不带电荷R基团氨基酸:7种—Ser Thr Asn Gln Try Cys Gly(表1-3)
(3)带负电荷R基团氨基酸:2种—Asp  Glu
(4)带正电荷R基团氨基酸:3种—Lys  Arg  His

硒代半胱氨酸:HSe-CH2-CH-COOH
2.蛋白质中几种重要的稀有氨基酸
在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,通常称为不常见蛋白质氨基酸。
这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。
其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。

    3.非蛋白氨基酸
  广泛存在于各种细胞和组织中,呈游离或结合态,但并不存在蛋白质中的一类氨基酸,大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。

   H2N-CH2-CH2-COOH    H2N-CH2-CH2-CH2-COOH
    非蛋白氨基酸存在的意义:
1.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分:D-Glu  D-Ala
2.作为一些重要代谢物的前体或中间体:-丙氨酸(VB3)、鸟氨酸(Orn)、胍氨酸(Cit)(尿素)
3.作为神经传导的化学物质:-氨基丁酸
4.有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体
  (刀豆氨酸)
5.调节生长作用
6.杀虫防御作用
绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。
三、  氨基酸的理化性质
  除甘氨酸外,氨基酸含有一个手性-碳原子,因此都具有旋光性。比旋光度(表1-7)是氨基酸的重要物理常数之一,是鉴别各种氨基酸的重要依据。         
2.氨基酸的光吸收
构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收,但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。
在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。
酪氨酸的&#61548;max=275nm,苯丙氨酸的&#61548;max=257nm,
  色氨酸的&#61548;max=280nm,

3.高熔点
4.一般均溶于水,溶于强酸、强碱;不溶于乙醚。
5.氨基酸一般有味

(二)氨基酸的两性性质和等电点
1.氨基酸的兼性离子形式
  氨基酸的两个重要性质:氨基酸晶体的熔点高(&#61619;200&#61488;C);氨基酸使水的介电常数增高。
            H
          H3N-C-COO-

              R


2.氨基酸的两性解离
在不同的pH条件下,两性离子的状态也随之发生变化。
氨基酸的等电点(isoeletric point)及其计算
氨基酸的等电点:当外液pH为某一pH值时,氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等,净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点,简称pI。在等电点时,氨基酸既不向正极也不向负极移动,即氨基酸处于两性离子状态。
氨基酸等电点的计算:侧链不含离解基团的中性氨基酸,其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值:pI = (pK’1 + pK’2)/2
   同样,对于侧链含有可解离基团的氨基酸,其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。
   酸性氨基酸: pI = (pK’1 + pK’ R-COO- )/2
   硷性氨基酸: pI= (pK’2 + pK’R-NH2 )/2






            小  结
1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。
2.在氨基酸等电点以上任何pH,AA带净的负电荷,在电场中向阳极移动;在氨基酸等电点以下任何pH,AA带净的正电荷,在电场中向阴极移动。
3.在一定pH范围中,溶液的pH离AA等电点愈远,AA带净电荷愈多。

(三)氨基酸的化学反应
      
(三)氨基酸的化学反应
1

脯氨酸与茚三酮反应的产物:
(三)氨基酸的化学反应
(三)氨基酸的化学反应
     AA
DNFB+  多肽
     蛋白

(三)氨基酸的化学反应

      

      

(三)氨基酸的化学反应


DNS +

6.侧链基团的化学性质
(1) 巯基(-SH)的性质
6.侧链基团的化学性质
(1) 巯基(-SH)的性质
6.侧链基团的化学性质
(1) 巯基(-SH)的性质
6.侧链基团的化学性质
(1) 巯基(-SH)的性质
6.侧链基团的化学性质
(2)羟基的性质
6.侧链基团的化学性质
(3)咪唑基的性质

蛋白质的化学修饰:是指在较温和的条件下,以可控制的方式使蛋白质与某种试剂(称化学修饰剂)起特异反应,以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。
回复

使用道具 举报

 楼主| 发表于 2004-12-23 23:28:50 | 显示全部楼层
第二节  肽(peptide)
一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键,所形成的化合物称为肽。


  肽键(peptide bond):
肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。
组成肽键的原子处于同一平面。
肽键
肽键中的C-N键具有部分双键性质,不能自由旋转。
在大多数情况下,以反式结构存在。

在多肽链中,氨基酸残基按一定的顺序排列,这种排列顺序称为氨基酸顺序
通常在多肽链的一端含有一个游离的&#61537;-氨基,称为氨基端或N-端;在另一端含有一个游离的&#61537;-羧基,称为羧基端或C-端。
氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始,以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为:
              Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
四肽的结构
三、肽的重要理化性质
1.每种肽也有其晶体,晶体的熔点都很高。
2.在pH0-14范围内,肽的酸碱性质主要来自游离末端&#61537;-NH2和游离末端&#61537;-COOH以及侧链上可解离的基团。
3.每一种肽都有其相应的等电点,计算方法与AA一致且复杂。
   
      B2+
三、肽的重要理化性质
4. 原则:当溶液pH大于解离侧链的值,占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱,当溶液pH小于解离侧链的值,占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。(P114例子)
5.肽的化学反应:也能发生茚三酮反应、Sanger反应、DNS反应和Edman反应;还可发生双缩脲反应。

肽的颜色反应
多肽可与多种化合物作用,产生不同的颜色反应。这些显色反应,可用于多肽的定性或定量鉴定。
  如黄色反应,是由硝酸与氨基酸的苯基(酪氨酸和苯丙氨酸)反应生成二硝基苯衍生物而显黄色。
多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。
  双缩脲能够与碱性硫酸铜作用,产生兰色的铜-双缩脲络合物,称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽,具有与双缩脲相似的结构特点,也能发生双缩脲反应,生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。
四、 天然存在的重要多肽
在生物体中,多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。
但是,也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能,常称为活性肽(active peptide)。
如:脑啡肽;激素类多肽;抗生素类多肽;谷胱甘肽;蛇毒多肽等。




            L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val
           &#61629;                      &#61629;
           L-Orn                 L-Orn
           &#61629;                      &#61629;
            L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

              短杆菌肽S(环十肽)
由细菌分泌的多肽,有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸(Ornithine, 缩写为 Orn)。


  CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH
回复

使用道具 举报

 楼主| 发表于 2004-12-23 23:30:07 | 显示全部楼层
第三节:蛋白质的分子结构
一、蛋白质的一级结构
二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白
三、蛋白质的三级结构
四、蛋白质的四级结构
      蛋白质的结构
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。
蛋白质与多肽并无严格的界线,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。




一、蛋白质的一级结构
1. 定义——  1969年,国际纯化学与应用化学委员会(IUPAC)  规定:蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序,包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序,它是蛋白质生物功能的基础。
  2.蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来,现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
(1)测定蛋白质一级结构的要求
a、样品必需纯(>97%以上);
b、知道蛋白质的分子量;
c、知道蛋白质由几个亚基组成;
     (2)   测定步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。
  通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。
        (2)测定步骤
B.多肽链的拆分。
  由多条多肽链组成的蛋白质分子,必须先进行拆分。

        ( 2)  测定步骤
B.多肽链的拆分。
  几条多肽链借助非共价键连接在一起,称为寡聚蛋白质,如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体;可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基).

         (2)  测定步骤
C.二硫键的断裂
  几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下,用过量的&#61538;-巯基乙醇(还原法)处理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂(ICH2COOH)保护生成的巯基,以防止它重新被氧化。

     (2) 测定步骤
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力;应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。
巯基(-SH)的保护

       (2)  测定步骤
  D.分析多肽链的N-末端和C-末端。
多肽链端基氨基酸分为两类:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。
在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。



Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下,能够与肽链N-端的游离氨基作用,生成二硝基苯衍生物(DNP)。
在酸性条件下水解,得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。



在碱性条件下,丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N-端氨基酸的游离氨基作用,得到丹磺酰-氨基酸。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质,检测灵敏度可以达到1&#61620;10-9mol。


此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。


氨肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。
最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。

羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。
目前常用的羧肽酶有四种:A,B,C和Y;A和B来自胰脏;C来自柑桔叶;Y来自面包酵母。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基;B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。
               (2)测定步骤
E.多肽链断裂成多个肽段,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。


  酶解法:
胰蛋白酶,糜蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,羧肽酶和氨肽酶



Trypsinase :R1=Lys和Arg侧链(专一性较强,水解速度快)。R2=Pro 水解受抑。

或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin):R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu,Met和His水解稍慢。
R2=Pro 水解受抑。

Pepsin:R1和R2=Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。
R1=Pro 水解受抑。

thermolysin:R2=Phe, Trp, Tyr; Leu,Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。
R2=Pro或Gly 水解受抑。
R1或R3=Pro  水解受抑。

谷氨酸蛋白酶: R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液);  R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液)

精氨酸蛋白酶: R1=Arg

化学法:可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法,它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。


化学法:可获得较大的肽段

羟胺(NH2OH):专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。

          (2)测定步骤
F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。

Edman (苯异硫氰酸酯法)氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。



测定每条多肽链的氨基酸组成

             (2)测定步骤
G.确定肽段在多肽链中的次序。
    利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

      示例(十肽的水解)
A法水解得到四个小肽:
          A1 Ala-Phe
          A2 Gly-Lys-Asn-Tyr
          A3 Arg-Tyr
          A4 His-Val
B法水解得到四个小肽:
          B1 Ala-Phe-Gly-Lys
          B2 Asn-Tyr-Arg
          B3 Tyr- His-Val

              (2)测定步骤
H.确定原多肽链中二硫键的位置。



一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多;酸性环境下防止二硫键发生交换)。
将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。





一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多;酸性环境下防止二硫键发生交换)。
将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。
然后同其它方法分析的肽段进行比较,确定二硫键的位置。

蛋白质的一级结构
   3.蛋白质一级结构举例
  (1)胰岛素(Insulin)

二、蛋白质的二级结构与纤维状蛋白
(一)构型与构象
    1.构型(configuration):指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。
        COOH              COOH
H2N   C    H         H    C    NH2
        R                   R
    2.构象(conformation):指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。

二、蛋白质的二级结构与纤维状蛋白
(二)蛋白质的构象
       一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下,只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性,并且相当稳定。这一事实说明了天然蛋白质主链上的单键不能自由旋转。
(二)蛋白质的构象
蛋白质多肽链空间折叠的限制因素:Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现:
  1.肽键具有部分双键性质:C-N单键键长0.149nm
                  C=N双键键长0.127nm
                  肽键键长0.132nm
  2.肽键不能自由旋转
  3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个&#61537;碳原子      (C&#61537;)都处于同一个平面内,此刚性结构的平面叫肽平面(peptide plane)或酰胺平面(amide plane)。
   
二面角的概念
蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离(A)

Ramachandran构象图
Ramachandran构象图
(二)蛋白质的构象
  蛋白质多肽链空间折叠的限制因素:Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现:
  1.肽键具有部分双键性质:
  2.肽键不能自由旋转
  3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个&#61537;碳原子      (C&#61537;)都处于同一个平面内,此刚性结构的平面叫肽平面(peptide plane)或酰胺平面(amide plane)。
   4.二面角所决定的构象能否存在,主要取决于两个相邻肽单位中,非键合原子之间的接近有无阻碍。
      (三) 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。
主要有&#61537;-螺旋、&#61538;-折叠、&#61538;-转角、自由回转。
1.&#61537;-螺旋及结构特点
多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转,形成螺旋结构,螺旋一周,沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基;两个氨基酸之间的距离为0.15nm;
肽链内形成氢键,氢键的取向几乎与轴平行,每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。
蛋白质中的&#61537;-螺旋几乎都是右手螺旋。

1.&#61537;-螺旋(&#61537;-helix )
&#61537;-螺旋是蛋白质中最常见,含量最丰富的二级结构。
&#61537;-螺旋中每个残基(C&#61537;)的二面角&#61542;和&#61561;各自取同一数值,即&#61542;=-57&#61616;、 &#61561;=-48&#61616; 。
&#61537;-螺旋有左手和右手螺旋,蛋白质中的&#61537;-螺旋几乎都是右手螺旋。
&#61537;-螺旋都是有L-型氨基酸构成的(Gly除外)。
&#61537;-螺旋的形成及其稳定性与其氨基酸组成和顺序有关(Pro、polyLys、PolyIle、PolyAla)。 &#61537;-螺旋折叠过程中存在协同性。
&#61537;-螺旋的书写形式为:3.613-螺旋


2.&#61538;-折叠(&#61538;-pleated sheet)
&#61538;-折叠或&#61538; -折叠片也称&#61538; -结构或&#61538; -构  象,它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。
&#61538;-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列,通过链间的氢键进行交联而形成的,或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象
2.&#61538;-折叠的特点
&#61538;-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的;也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联,氢键与链的长轴接近垂直。
&#61538;-折叠有两种类型:一种为平行式,即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式,即相邻两条肽链的方向相反。
  3.&#61538;-转角(&#61538;-turn) 亦称: &#61538;- reverse turn, &#61538;-bend
在&#61538;-转角部分,由四个氨基酸残基组成;
弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 –N-H 之间形成氢键,形成一个不很稳定的环状结构。
这类结构主要存在于球状蛋白分子中。


4.无规卷曲或自由回转(nonregular coil)
指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。

酶的功能部位常包含此构象,灵活易变。
(四)  超二级结构
1.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位(&#61537;-螺旋或&#61538;-折叠或&#61538;-转角)组合在一起,形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
2.超二级结构的基本类型:&#61537;&#61537;、 &#61538;&#61537;&#61538;、&#61538;&#61538;&#61538;


       纤维状蛋白
  纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内,它是动物体的基本支架和外表保护成分,  占脊椎动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。
这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状,分子轴比(长轴/短轴)大于1()(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构,这与其多肽链的有规则二级结构有关,而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。
纤维状蛋白质的类型
纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性两类,前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等;
后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等,但不包括微管(microtubule)和肌动蛋白细丝(actin filament),它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。
    角蛋白 Keratin
角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物,如毛发、甲、角、鳞和羽等,属于结构蛋白。角蛋白中主要的是&#61537;-角蛋白。
&#61537;-角蛋白主要由&#61537;-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手&#61537;-螺旋肽链形成一个原纤维(向左缠绕),原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性
例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列,并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。
&#61537;-角蛋白的伸缩性能很好,当&#61537;-角蛋白被过度拉伸时,则氢键被破坏而不能复原。此时&#61537;-角蛋白转变成&#61538;-折叠结构,称为&#61538;-角蛋白。
毛发的结构
一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell),中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20&#61549;m。在这些细胞中,大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。
毛发性能就决定于&#61537;—螺旋结构以及这样的组织方式。

角蛋白分子中的二硫键
卷发(烫发)的生物化学基础
永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),&#61537;—角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为&#61538;—构象,但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。
这是因为&#61537;—角蛋白的侧链R基一般都比较大,不适于处在&#61538;—构象状态,此外&#61537;—角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联,这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(&#61537;—螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。
(2)&#61538;-角蛋白
丝心蛋白(fibroin):这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高,质地柔软的特性,但不能拉伸。丝心蛋白是典型的反平行式&#61538;-折叠片,多肽链取锯齿状折叠构象。
丝蛋白的结构
丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向&#61538;-折叠结构。分子中不含&#61537;-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为:
  -(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n-
三、蛋白质的三级结构
1.蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上,进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。
结构域:指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上,进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。


2.维持三级结构的作用力

氢键
范德华力
疏水键(疏水相互作用)——在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用。
离子键(盐键)
二硫键
疏水键,在蛋白质三级结构中起着重要作用,它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。

2.维持三级结构的作用力
3.肌红蛋白的结构与功能
(1)肌红蛋白的功能:哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。
(2)肌红蛋白的结构特点:&#61500;1963年,Kendrew&#61502;
  a .一条多肽链,153个氨基酸残基,一个血红素辅基,分子量17600。
  b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构,肽链共折叠成8段较直的&#61537;-螺旋体(A-H),最长的有23个氨基酸残基,最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。
  c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面,而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部,使肌红蛋白成为可溶性蛋白。

血红素(铁卟啉 )辅基的结构及其氧合部位
煤气中毒的机制
一氧化碳(CO)也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红素的结合能力是O2的200倍,因此,人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合,从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中(如新鲜空气、纯氧气或高压氧气),使与血红素结合的CO被O2置换出来。
(3)肌红蛋白的氧合曲线

Y=
肌红蛋白的氧合曲线
Hill曲线:
四、蛋白质的四级结构
         四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结构的亚基按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。
  通常亚基只有一条多肽链,但有的亚基由两条或多条多肽链组成,这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。
   亦可以说,具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白或多体蛋白。(寡聚蛋白中亚基可以是相同的或不相同的,亚基相同时,分子具有对称性)
  实质:蛋白质的四级结构实际上研究亚基之间的相互作用、空间排布及亚基接触部位的空间布局。

2.维持蛋白质四级结构的主要作用力
在蛋白质四级结构中,亚基之间的作用力主要包括:氢键、离子键、范德华力和疏水键。

即亚基之间通过次级键彼此缔合在一起(二硫键?)

疏水键是最主要的作用力。
3.血红蛋白的结构与功能
(1)血红蛋白的功能:存在动物血液的红细胞中,具有运输O2和CO2的功能;血红蛋白还能和H+结合,从而可以维持体内pH.
(2)血红蛋白的结构特点:
a.是四个亚基的寡聚蛋白,574个AA残基,分子量65000
b.成人的血红蛋白为&#61537;2&#61538;2(HbA-96%)、&#61537;2&#61540;2( HbA2-2%)胎儿的血红蛋白为&#61537;2&#61543;2(HbF)
c. &#61537; 链由141AA残基组成, &#61538; &#61540; &#61543; 链由146AA残基组成。
   四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似,各自内部有一个血红素辅基。

(3)氧合引起血红蛋白的构象变化
      
         
别构蛋白的结构特点
都是寡聚蛋白质,有四级结构.
分子中每个亚基上都有活性部位,或者还有别 构部位;某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。
不同亚基各部位之间存在相互作用,部位之间的影响是通过构象变化传递的.



          同种效应
           (homotropic effect)
B.氧合引起的血红蛋白的构象变化
非氧合蛋白中四个亚基间的相互作用

        
                O-    O-
                   C        O
                  HC   O    P    O-
                  HCH      O-
                   O
                O  P  O-
                   O-
与氧结合时血红蛋白的变构过程
血红素中铁原子的变化
     高自旋状态                    低自旋
(非氧合,原子半径较大)      (氧合,原子半径较小)
与氧结合时血红蛋白的变构过程
亚基三级结构及整个蛋白四级结构的变化
      



      
       T构象    R 构象

C. 血红蛋白的氧合曲线
   血红蛋白的氧饱和度(Y)定义为:

Y=
血红蛋白S形氧合曲线的生理意义

D. H+、CO2和DPG 对血红蛋白结合氧的影响
  氧亲和力:指血红蛋白对于氧的结合牢固程度,表示为PO  (P50)。(在一定氧分压下,氧亲和力越高,即氧结合越牢固。相反,氧亲和力越低,组织就能得到更多的氧供应)


DPG的影响:
   HbO2&#61502;Hb(O2)2&#61502;Hb(O2)3
Hb-DPG  &#61614;  Hb(O2)4+ DPG
DPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义: DPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时,红细胞中的DPG可促进氧合血红蛋白释放氧,以满足组织对O2需要。 DPG浓度越大, O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例:在高山上;肺气肿病人;储藏血液。

E.胎儿血红蛋白的氧合能力大于HbA
胎儿血红蛋白(HbF)为&#61537;2&#61543;2,而成人血红蛋白(HbA)为&#61537;2&#61538;2,
  &#61538;与&#61543;的区别为: &#61538;143—His
               (DPG与&#61538;亚基的结合部位:      
                  Val1-&#61537;-NH3+
                  Lys82-&#61541;-NH3+
                  His143-咪唑基)
    &#61543;143——Ser,使HbF与DPG的结合能力减弱,因而增加了HbF对氧的亲和力。其意义在于胎儿血液流经
胎盘时HbF可以从母体HbA获得O2。
回复

使用道具 举报

发表于 2004-12-29 23:27:38 | 显示全部楼层
太累,何不发个FTP?
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 注册

本版积分规则

Archiver|手机版|小黑屋|网上读书园地

GMT+8, 2024-11-1 21:37 , Processed in 0.182716 second(s), 5 queries , Redis On.

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表