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细胞按要求培养,抽RNA, 反转录为cDNA。
有细胞计数,测RNA 浓度(分光光度计)等环节。
选择反应物,
待测样本:0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九种
阴性对照:即无模板对照, NTC
作为标准的样品:如果有必要做标准曲线的话,选择一种比较容易准确定量的DNA (如果是
进行绝对定量分析,则需要浓度完全已知的DNA 标准品——要求:能够被引物所扩增,比
如,其他种类细胞的cDNA, 或,克隆有DNA 片段的质粒载体)。
选择引物(基因)
endogenous control 使用的持家基因:GAPDH(甘油醛脱氢酶
转录水平待测的基因
因为每个反应管要做3 次重复以上,所以应该准备好充足量的 PCR 试剂,推荐——先混合
得到Master Mix, 再分至各个反应管。
※标准曲线和待测样品其实应该在同一次real time PCR 中做。第一次做的话,试验的成分
更多些,所以,重复数应该大一些(4),这样就不得不把标准曲线和待测样品分开了。等到
扩增曲线能够被完美地,轻松地得到后,就可考虑减少重复数(至少3 吧), |
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