[转载]Western 杂交方法

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作者：原版主 深山含笑

Western 杂交方法

3.1 Western所需试剂

3.1.1 Acr-Bis (29:1)　30% w/v

29g Acr, 1g Bis, 加入重蒸水定容至100ml，过滤，避光4℃保存。

3.1.2 分离胶buffer (4×)

1.5mol/L Tris-HCl (pH8.0)　 0.4% (w/v) SDS

45.4g Tris, 10ml 10%SDS, 浓HCl约10ml, 调pH至8.8, 用重蒸水定容至250ml。 3.1.3 浓缩胶buffer (4×)

0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)　 0.4% (w/v) SDS

15.15g Tris, 10ml 10%SDS, 浓HCl约10ml，调pH至6.8, 用重蒸水定容至250ml。

3.1.4 上样buffer (2×)

0.25mol/L Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS, 20%甘油，痕量溴酚兰

50ml浓缩胶buffer (4×), 4g SDS, 20ml甘油，2mg溴酚兰，用重蒸水定容至100ml。

3.1.5 Tris-甘氨酸电泳buffer (10×) 1000ml

800ml重蒸水加热溶解2g SDS，加入30.2g Tris碱，144g甘氨酸，重蒸水定容至1000ml。

3.1.6 考马斯亮兰染液R250

225ml重蒸水溶解1.25g考马斯亮兰R250，225ml甲醇，50ml冰醋酸

3.1.7 转移buffer

750ml重蒸水溶解3.03g Tris, 14.4g 甘氨酸，200ml甲醇，加水定容至1000ml。

3.1.8 TBS (10×)

750ml 重蒸水溶解12.12g Tris, 88g NaCl, HCl 调节pH至8.0, 重蒸水定容至1000ml。

3.1.9 TBST (1×)

100ml TBS (10×), 0.5ml Tween-20 (0.05% v/v), 重蒸水定容至1000ml。

3.1.10 封闭液

0.3g BSA (3% w/v)溶于10ml TBST中。

3.1.11 AP缓冲液(10×)

　　　80ml重蒸水溶解0.59g NaCl, 0.102g MgCl2, 1.212g Tris-HCl, HCl调pH至9.5, 重蒸水定容至100ml。

3.1.12 NBT母液

　　　10ml 70%二甲基甲酰胺溶解0.5g NBT。

3.1.13 BCIP母液

　　　10ml 100%二甲基甲酰胺溶解0.5g BCIP。

3.1.14 丽春红染色液

　　　0.1g丽春红溶于5ml乙酸，加入重蒸水定容至100ml。

3.1.15 10% SDS-PAGE凝胶电泳分离胶的配制(10ml):

　　　4ml水，3.3ml 30%丙烯酰胺，2.5ml 1.5M Tris (pH8.8), 0.1ml 10% SDS, 0.1ml 10%过硫酸铵，4μl TEMED。

3.1.16 5% SDS-PAGE凝胶电泳浓缩胶的配制（5ml）

　　　3.4ml水，0.83ml 30%丙烯酰胺溶液，0.63ml 1M Tris(pH6.8), 50μl 10% SDS, 50μl 10%过硫酸铵溶液，5μl TEMED。　　

3.2　Western操作程序

3.2.1 装好电泳系统，加入电极buffer, 上样。10/15 孔2mm样品最多上样36/28μl。

3.2.2 稳压200V，至溴酚兰刚刚跑出分离胶，约需1－1.5小时。

3.2.3 卸下胶板，染色，室温染1－2小时，沸水脱色。

3.2.4 剪与胶等大的NC膜，四张滤纸，将NC膜，滤纸和海绵浸入转移buffer中，至少5分钟。

3.2.5 按（-）黑板－海绵－滤纸－胶块－NC膜－滤纸－海绵－红板（+）装好，除尽气泡。

3.2.6 4℃，100V转移1小时。

3.2.7 取出NC膜，浸入10ml封闭液中，37℃ 1-1.5小时。

3.2.8 倒出封闭液，4℃可保存2周。

3.2.9 按效价加入一抗于10ml TBST中，37℃ 1小时。倒出一抗，4℃可保存2周，20ml TBST清洗10分钟3次。

3.2.10加入二抗于10ml TBST中，37℃ 1小时，倒出二抗，4℃可存2周，20ml TBST洗10分钟3次。

3.2.11加入10ml AP buffer, 66μl NBT母液，33μlBCIP母液，混匀现色2－5分钟至条带出现，取出NC膜，置于20ml重蒸水中，终止反应并清洗2－3次。

3.2.12 晾干，保存于保鲜膜中。



4　线粒体提取

4.1 取 4g材料加入10ml线粒体提取缓冲液（0.4M 蔗糖，50mM MOPS-NaOH, 5mM EDTA, 0.2%BSA, 4mM Cys, pH7.7）.

4.2 四层纱布过滤。

4.3 滤液在1500g离心10min。

4.4 取上清，在15000g离心20min。

4.5沉淀重悬于洗涤介质中（0.4M蔗糖，10mM MOPS-NaOH, 1mM EDTA, 0.2%BSA, pH7.2）。

4.6 1000g 离心10分钟。

4.7 转移上清到一个干净的离心管中，在其下层铺一个8ml的液体梯度，含10mM MOPS, pH7.2, 0.6M 蔗糖，1mM EDTA, 0.2%BSA。

4.8 9250g离心10分钟。

4.9 除去上清，沉淀溶于1-2ml的呼吸缓冲液中（0.25mM蔗糖，10mM MOPS，2mM MgCl2，2mM磷酸钾和0.2%BSA，pH7.2）。



5 考马斯亮兰法测定蛋白质含量

5.1 溶液的配制

5.1.1标准蛋白溶液的原液配制：10mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，配成100μg/ml原液。

5.1.2 考马斯亮兰G－250试剂的配制：100mg考马斯亮兰G－250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100ml，用蒸馏水定容至1000ml。



5.2 测定步骤

5.2.1 系列标准蛋白溶液的配制：

1# 2# 3# 4# 5# 6#

标准液（μl） 　0 　200 　400 　600 　800 　1000

蒸馏水（μl） 　1000 　800 　600 　400 　200 　0

蛋白含量（μg） 　0 　20 　40 　60 　80 　100



5.2.2 准确吸取各标准溶液及待测溶液200μl，加入考马斯亮兰G－250试剂1000μl，放置2分钟后，于595nm下比色，作出标准曲线，根据标准曲线计算样品的含量(单位：μg/μl)。