肝癌原代细胞纯化

liqiu

肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养
法均可。
(一)要点
1．取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，
取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后
宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜超过24 小时。

2．培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培养基
等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤
细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine) 性
产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿
瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之伺对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培
养中仍需要生长因子，有的还需特异性生长因子(如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关
生长因子培养更易成功。
3．成纤维细胞的排除：
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂
生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤
维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能
压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维
细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除
成纤维细胞有多种方法
(二) 成纤维细胞排除法
1．机械刮除法：
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)，或裹少许脱脂棉制成，装入试管
中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为：
(1) 标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
(2) 刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
(3) 用Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
(5) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
2．反复贴壁法：
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度馒的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细
胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同：
(1) 细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2 次，加入不含血清的培养液，
吹打制成细胞悬液；
(2) 编号为A、B、C 三个培养瓶；首先把悬液接种入A 培养瓶中，置温箱中静止培养5—20 分钟后，
轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B 培养瓶中后；向A 瓶中补充少许完
全培养液置温箱中继续培养；
(3)A 瓶中细胞5~20 分钟后，按处理A 的方法，把培养液注入C 培养瓶中；再向B 瓶中补加完全培养
基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A 瓶主要为成纤维细
胞，B 瓶两类细胞相杂，C 瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：
法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
(1) 先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA (1:1) 混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续
消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
(2) 把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的
培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细
胞除净。

4．胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1) 可用0．5mg／m1 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，
即终止消化；
(2) 用Hanks 洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞末被除净，
可再次重复。
5．其它方法：
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025 ~ 1.085 的密度
梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g 离心10 分钟。在比重1.025 ~ 1.050 层为成纤维细胞，在比
重1.065 ~ 1.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD 抑制成纤维细
胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
(三) 提高肿瘤细胞培养存活牢和生长率措施
根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞
初代接种培养后，常出现以下几种情况：
① 完全无细胞游出或移动；
② 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；
③ 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；
④ 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细
胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获
得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。
1．适宜底物：
如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2．生长因子：
应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生
长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。
3．动物体媒介培养：
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞) 的数量，可采用动物体转嫁
接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。
(1) 瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks 液洗净血污，切成1—3 毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，
用酒精棉球擦拭动物腋部后，直接刺入皮下，注入瘤块；
(2) 饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织；
(3) 进行体外培养。
(4) 为防止失败，仍取部分瘤组织继续在棵鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量
增多，细胞培养易于成功。
肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。