RT-PCR相关

yujian623

一、组织抽提：
1.  取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2.  移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3.  移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4.  冰上孵育5分钟
5.  离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6.  加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟
7.  离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8.  加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟
9.  离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10.  加入1 ml 75%乙醇，震荡
11.  离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液
12.  室温下使之变透明
13.  加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）
14.  走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度
二、RT反应体系（第一步）：约20分钟
RNA  抽提物  5μl
Radome 引物  2μl
RNA sin  0.5μl
1.  65℃ 15分钟
2.  立即放入冰浴
RT反应体系（第二步）：约2小时
RNA sin  0.5μl
10mM dNTP  1μl
5×RT 缓冲液  4μl
25mM MgCl2  4μl
AMV 逆转录酶  3μl
1.  37℃ 1.5小时
2.  94℃ 5-10分钟
3.  反应物保存于-20℃或进行PCR
三1、PCR反应体系：约4.5小时
25mM MgCl2  2μl
10×PCR 缓冲液  5μl
10mM dNTP  1μl
上下游引物10pmol/μl  2.5μl×2
CDNA模板  2.5μl
ddH2O  34μl
Taq酶  0.5μl
轻质石蜡油  50μl
100μl
1.  94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.  94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环
3.  72℃ 10分钟
4.  取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
三2、PCR反应体系：约5小时
25mM MgCl2  3μl
10×PCR 缓冲液  5μl
10mM dNTP  1μl
上下游引物10pmol/μl  2.5μl×2
CDNA模板  5μl
ddH2O  30μl
Taq酶  1μl
轻质石蜡油  50μl
100μl
1.  94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.  94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环
3.  72℃ 10分钟
4.  取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
四、电泳：约1.25小时
1.  配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml
2.  胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）
3.  微波炉中火2分钟溶解胶
4.  冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）
5.  放入梳子，浇板，待凝固
6.  加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰
7.  电泳50-80V（每㎝ 5V）