制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧

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硝酸纤维素膜又称为NC膜，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。所以NC膜成为该试验中最重要的耗材，而由于其属于非标准器件，基本上每个项目开始阶段都会遇到如何选择合适的NC膜的问题。同时也存在是否要对NC膜进行，期处理及如何处理的讨论。
膜的生产原理 ;
    这个虽然看上去属于生产厂商的事情，但是GMP有个观点是强调对过程的控制才会有好的结果。那么只有了解NC膜的大致生产过程和基本原理才能更好的掌握这种材料的特性，最终制作出满意的试纸.你了解吗？生产NC膜的过程和普通的造纸过程是非常类似的，我们可以借鉴对造纸的认识来理解。
（1）首先，匀浆配比
    购买回的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物，溶解形成混浆，在该浆体内，会加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质，一般是一个试剂配方，主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解在一个缓冲体系内。 不同的厂家加入的溶液配方不一样，直接导致了在产品的差异。
    （2）其次，滚筒铺膜
    配好的匀浆通过滚筒，形成了一张薄膜，平摊在十分光滑的平面载体上。这个和造纸的过程是非常相似的。
    （3）最后，成型
  在匀浆内的成型剂开始挥发，膜逐步干燥成型。同时在这个过程中由于温度比较高，有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型，同时补充配方溶液的形式，来避免一些有效成分的蒸发
    （4）切割出产品
    通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品，宽度的大小直接和滚筒的大小相关，滚筒越大生产越方便，但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm（或20mm）宽，而长度上，成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度，但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加，后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中，综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度，以次为标准.关于不同宽度的用途差异，稍后详述。
@    从生产的过程，我们可以得知，NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的缓冲系统（虽然对纸条测试影响不会很大）。对后面谈到的一些问题就比较容易理解

2．NC膜的供应商及现状
: 现在有销售的NC膜品牌型号如下：
  MILLIPORE（美国），M135（有背衬/无背衬两种） M180（有背衬/无背衬两种） .
    WHATMAN and S&S，Puraband impuraband ,    SARTORIUS（德国），CN140
  伊能（国产），8um 6um
  MDI（印度），8um 6um
说到这些供应商，不得不谈谈发展的历史. S&S是膜行业的鼻祖，这点所有的膜公司都承认。millipore，SARTORIUS和whatman都是后辈，我的理解是S&S在市场竞争的过程中经营方式落后，最后被whatman收购。就产品质量来说S&S的AE99和AE98是非常优良的。
而MDI是近年才出现的一个膜公司，可能也是与印度胶体金试纸生产行业的快速发展密切相关，其所有的产品都是在印度生产，经营者为父子两人，父亲负责技术，儿子进行经营。03年我曾测试过其样品，结果发现在跑板方面有不均匀波浪现象，且加速稳定性试验结果很不理想。今年初我又收到了一些样品，情况仍然没有太大改善，后来就不再考虑使用了。
  国产膜伊能是在去年开始进入市场的，主要特点是能降低成本，样品我也试测了几批，性能已经与进口膜很接近，经过一些有针对性的优化后可以用在HCG产品的生产。但不是所有的工厂都能购轻易的完成这个优化工作。膜的国产化是一个趋势，但进口厂家要实现国产化还面临很大的问题，其中厂房设备的搬迁就是一个非常大的问题。
销售模式都是直销式，少量购买的情况下要通过代理商走一下帐。价格上MILLIPORE与WHATMAN相当，SARTORIUS便宜一些，国产膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS价格相同，基本不用考虑。在科研市场，MILLIPORE使用最多。科研市场由于仅用来试验，所以膜需求量小，不被供应商重视。生产客户中，MILLIPORE，WHATMAN，SARTORIUS占有量相当，伊能现在也开始有一些工厂客户了，MDI量最小投诉也最多。3．膜的选择
  以上谈了该行业的一些发展现状，那么我们大致了解后，回到最关心的问题，如何选择膜？经常会遇到的问题是，我是做**项目的，我该选择那类膜？ '    这里涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um，但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么？
    um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流。    换算情况大致为：8um=135s；6um=180s

不同秒数的膜对反应有什么影响呢？ :
    首先，我们分析一下液体在膜上的运动过程。一张长度为4cm的膜， 每隔1cm做一个标记， 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。而两张不同秒数的膜（例如135s， 180s）在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察，可以考虑用色素水溶液，非常明显。
    那么从这个试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。
其实我们并没有那么多选择。经过使用实践，各供应商一般都只提供两个型号，就是135s和180s。 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多，但这两个型号的定货量就占了95%以上，其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利。135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 你所要做的是，先选择其中的一个型号， 然后比较不同供应商同一个型号的差异，由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同，这个差异可能大也可能小。具体要根据试验结果来确定最后的选择。我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜，这样成本高，成功的几率也小。

膜的质控方式
  本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说，厂家的质控标准已经完全能满足你的要求，而不需要自己再做相关的质控。     膜的质控虽属于原辅料QC职能，但由于其专业性强，一般都由小样调试人员来执行。膜入原料库后需要进行如下检验工作：
    （1）查收COA
在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书， 该证书被称为COA。如果你已经购买某一批次的膜， 而没有索取相应的证书， 如果有需要可提供批号向厂家要求补发。其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯
    COA一般只提供给大客户， 对小客户是没有意义的。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。
2）检查物理性能 !
    膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度。长度不需要检测。使用中可以关注长度上是否有断面重接现象， 断面多费料则多， 少数发生。厚度，由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均。膜生产的必测参数。主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速。宽度，普通直尺测量。物理性能一般都不会有什么大问题。毕竟检测标准客观，易把握。没有条件执行的厂家可省略。
    （3）跑水性能
    样本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易观测，需制作一个简易支架。
操作：注入足够溶液到下部槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。(
    （4）点样测试
线出线时间，其他试验条件相同情况下，记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。\"
    灵敏度，比较不同样本浓度情况下，T线的变化是否和对照组同。一般每批次膜取前端一段用来测试即可。由于制造过程的不均一性， 不同批号的灵敏度会有一定差异，当大批量使用时，这种差异影响是非常大的，那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类。在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来。当进入后期生产调用时，就能根据这些分类，按照订单要求取用不同批号的膜，或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。
    关于膜的批内差。批内差是肯定存在的，只是差距大小的问题，依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值，因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试。减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。前面说过膜的生产方式，生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面，要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间部分，和边缘部分之分.越靠近中间部分，膜的均匀性越好，边缘部分则相对要差，就造成了批内差。一般可以通过COA获得具体位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。
如果是试用某个型号的膜小样，还需要在以上检测后加入膜加速老化试验，包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验， 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。

5．膜的深入探讨和应用技巧 :
    从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧
    （1）蛋白与膜的结合原理 ,
    蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力\\H键\\静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：
  1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
    2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。
  两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
（2）膜对结合的影响 .
    1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。
另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
  2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
    1)生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。
    2)处理过程不同
    （3）生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
    1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
    首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。 .
    2）缓冲液
    大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持，而不同机构的反应体系又有差异。想获“鱼”先学“渔”。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整。我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
少量NACL，减少信号强度，消假阳。
  有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
  表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。( n7 }$ W& K! J6 W
    调PH到某个位置，可以消假阳。
（4）点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
    （5）点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
（6）膜的宽度与点样位置
    膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
（7）溶液在膜上的扩散
    溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
    （8）点膜前后的封闭作用
    从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种：流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头，可以将不合格的半成品大板重新复活。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响，具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
（9）膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。