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脂肪组织来源的基质细胞及其在神经系统疾病中的应用（相关版权保留）
神经细胞损伤后的组织修复与功能重建一直是神经疾病治疗上的难题。自1998年成功分离人类胚胎干细胞以来，干细胞由于具有分化为多种组织细胞的能力，以及起潜在的临床应用价值，立即引起了世界的关注。近年来随着基因技术和细胞技术的发展，利用干细胞治疗疾病的尝试已经开始，中枢神经系统疾病如帕金森病（Parkinson’s disease, PD），遗传性进行性舞蹈病（Huntington’s disease, HD），脑卒中等的细胞移植治疗在基础实验研究和临床研究上都已经获得一定的疗效，但是难以广泛开展。因为供体来源有限，现在解决该问题有三个办法：（1）利用自体神经细胞（如神经干细胞）体外培养扩增后再移植到中枢神经系统内，可以克服异体移植的免疫排斥。但中枢神经系统的细胞位置深在，获得细胞必然对身体造成损伤，体外培养也有一定的技术困难。（2）取流产胚胎组织的脑组织，分离神经干细胞，在体外大量培养扩增后移植到中枢神经系统内，但这样必然面临着伦理学的问题而无法回避。（3）取异种胚胎神经干细胞（如鼠和猴）培养后移植。但是该方法可能出现安全性和免疫排斥，例如可能会将猴的人兽共患病传染给人等。另外，人们对异种移植的心理接受能力也是个问题[1]。由于细胞移植的供体来源存在以上的缺陷，现在国内外学者多致力于应用组织工程技术进行组织修复与功能重建的研究。组织工程是应用细胞学和工程学的原理，对病损组织结构、功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科[2]。其方法是将分离到的自体高浓度细胞即种子细胞，经体外培养扩增后种植与一种天然或者人工合成的，具有良好生物相容性，并可被人体逐步降解吸收的细胞支架上。种子细胞研究是组织工程项目中的一个重要课题。近年来国内外学者对种子细胞的研究主要集中在干细胞的分离培养、基因调控、信号转导与表型特征等方面[3]。
未来的细胞治疗和组织工程主要应用自体的多能干细胞作为种子细胞，其中一种种子细胞来源是骨髓基质细胞，骨髓腔中含有几种细胞成分，其中间充质干细胞能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞[4, 5]，但骨髓的抽取往往给患者造成痛苦，且来源有限，每个成人每次只能抽取10～20 ml骨髓，所以其广泛应用受到限制[6]。另外一种潜在的自体干细胞来源于脂肪组织，它的获取相对容易，我们称之为脂肪基质细胞[7, 8]。本文将重点综述脂肪组织来源的基质细胞(ADASc)的生物学特性和治疗神经系统疾病的研究进展作一介绍。
1．脂肪组织来源的基质细胞分离培养
早在上世纪60年代，Rodbell首先建立了从啮鼠动物的脂肪组织中分离细胞的方法[9]。主要内容是切碎组织，胶原酶消化，随后离心去除表面漂浮的脂肪组织，获得基质血管层。这种方法修改后已经被一些研究机构成功地应用于huADASc的分离培养[7, 10- 19]。此时huADASc可混有内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、周皮细胞、成纤维细胞等，但是这些细胞的量是相当少的，而且在细胞换液和传代过程中可以起到纯化细胞的作用，传代到第3代的ADASc已经基本没有杂质细胞[20]。
2. 脂肪组织来源的基质细胞的生物学特征
早在上世纪60年代，Rodbell首先从啮鼠动物的脂肪组织中分离出ADASc[9]。2001年Zuk等[18]首先证实了ADASc的多向分化潜能。他们发现ADASc在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞可以在15代之内在体外相对稳定地进行培养并保持多向分化潜能[18]。
ADASc与骨髓间充质干细胞相比，具有来源广泛，取材方便，易于分离获取的优点。目前应用流式细胞技术，免疫细胞化学技术已经成功地鉴定出分离的未分化的ADASc的表面标记物。其中阳性表达物有CD9, CD10, CD13, CD29, CD341, CD44, CD49d, CD54, CD55, CD59, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD166, α-平滑肌肌动蛋白，Ⅰ型胶原，III型胶原，HLA-ABC，骨桥蛋白，骨桥蛋白，波形蛋白；阴性表达物有CD11, CD14, CD16, CD18, CD31, CD45, CD50, CD56, CD62,CD104, CD133, FVIII相关抗原，HLA-DR, Stro-1。这些由不同的研究机构发现的表面标记物很多相互一致，但是不完全相同。对于这种现象有几种不同解释，可能是由于成体脂肪基质细胞分离方法微小差异导致，可能是ADAS细胞在培养基的培养时间不同所致，可能是消化组织时胶原酶的选择，纯度和浓度导致。还有可能是单克隆抗体识别同一抗原不同位点所导致，或者流式细胞技术所得结果和免疫细胞化学技术所得结果差异所导致。然而不同患者来源的ADAS细胞的总体蛋白表达水平异常相似[17, 18, 21- 25]，这一发现对解决ADAS细胞鉴定问题具有重要意义。近年来许多研究机构在Rodbell[9]建立的分离鼠ADAS细胞方法基础上成功分离培养huADASc，不同文献描述的huADASc的分离方法稍有不同，大概可以分为两大类：一类是来源于外科手术时取下的脂肪组织，另一类是抽脂术时获得的脂肪组织。前一种办法是将脂肪组织机械分割，胶原酶消化，裂解红细胞并洗涤胶原酶及裂解液残余后以一定浓度接种于培养瓶中，37℃、5%C02及饱和湿度下培养，经过细胞换液和传代过程中可以起到纯化细胞的作用huADASc得以纯化而继续培养，一般传代到第3代的huADASc已经基本没有杂质细胞[10- 18, 20, 26]。后者使用的组织由于是抽脂术所得到的样本，已经经过切碎，减少了冗长的组织机械分割实验步骤，余下步骤同前者，研究显示抽脂术并没有降低脂肪组织里的细胞活力[13, 14]。
ADASc是来源于中胚层的干细胞，具有很强的活力，细胞衰老水平低。从β-gal染色分析可以得知，在PH6.0的情况下，衰老细胞表达β-gal，而增殖的细胞不表达β-gal。Zuk等人发现ADAS细胞从第1到第15代之间的每代都进行β-gal染色并进行分析。在第1代没有见到β-gal染色的阳性细胞。随后β-gal染色阳性的细胞随着细胞传代代数的增加而增多。但是10代以内的β-gal染色阳性细胞数低于5%。15代之内的β-gal染色阳性细胞数低于15%。因此ADAS细胞可以在体外长期相对稳定地进行培养[18]。
3. ADASc向神经元样细胞分化潜能
关于ADASc向神经元样细胞分化潜能已经被一些实验证明。目前应用免疫细胞化学技术可准确、方便地鉴定诱导分化后的ADASc细胞。神经干细胞的特异标志物有波形蛋白(vimentin)、巢蛋白(Nestin)和musashil蛋白；神经元的特异标志物有神经元特异性烯醇酶( neurorrspecific enolase，NSE)、神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、中间神经丝(NF-M)、tau蛋白和一些微管蛋白如tubulin-β、微管联合蛋白2（microtubule-as-sociated protein-2，MAP-2）、TuJ-1；星形胶质细胞的标志物是神经胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein，GFAP)；少突胶质细胞的标志物有碳酸苷酶II(carbinic anhydraseⅡ,CA II)、半乳糖苷酶( Calc)。小胶质细胞的标志物为离子钙接头分子（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1）。S100是在大脑的星形胶质细胞中发现的钙结合蛋白，他们在胚胎神经胶质细胞形成过程中都可以检测到; γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统主要的抑制性的神经递质。NMDAR-1和NMDAR-2是谷氨酸受体的亚单位，GABA在早期星形胶质细胞或者其他胶质细胞中以非突触递质信号的形式表达；生长相关蛋白-43 (GAP-43) 存在于正常脑组织正在生长的神经元和成熟神经元的轴突中；突触蛋白I（Synapsin I）是种突触小泡蛋白，存在于正常脑组织神经元的轴突中，在神经元的生长和神经递质释放的调节中有一定作用[27, 28]。所以可以运用免疫组化方法来鉴定ADASc诱导分化后不同阶段、不同时期的细胞表达的标志物。
3.1 体外研究
Safford[15]等人于2002年首次对Balb/C小鼠和健康人的脂肪组织来源的基质细胞向神经细胞方向分化的潜能进行了初步探索。他们使用4-羟基茴香醚( butylated hydroxyanisole，BHA)，丙戊酸和福斯高林等作主要诱导剂，在体外成功地诱导第4到5代的ADASc分化为神经元和胶质细胞，诱导后的细胞可表达神经前体细胞标志物巢蛋白，神经元标志物神经元特异性核蛋白和星形胶质细胞的标志物是神经胶质纤维酸性蛋白，同时huADASc还可以检测到NF-M的表达。他们还使用流式细胞计量术比较了人和鼠的ADASc表面标记物，发现两者拥有相同的细胞表面标记物。在实验中他们观察到ADASc在诱导分化过程中胞体向外伸出突起是胞体逐渐回缩而非细胞生长的结果。Zuk[17]等人用β-ME (beta-mercaptoethanol，β-ME)、二甲基亚矾(dimethylsulfoxide DMSO)和4-羟基茴香醚( butylated hydroxyanisole，BHA)等作主要诱导剂也在体外成功诱导huADASc向神经元样细胞分化，这些诱导后的细胞表达了Nestin，NeuN，NSE，未见其他神经方向的细胞标志物的表达，这些结果与Safford等人的研究结果相似，但是他们在实验中发现未诱导组ADASc表达了Nestin。Ashjia等人[10]使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），吲哚美辛和胰岛素也可以诱导huADASc表达vimentin，NSE，NeuN，神经生长因子受体trk-A，同时这些蛋白的表达量随着诱导时间的增长而增加。他们发现经过2周左右的培养，大约有20%-25%的诱导后的细胞呈现典型的神经细胞形态，他们的研究未能检测到神经元的标志物MAP-2和成熟星形胶质细胞的标志物GFAP。他们还发现向神经方向诱导分化的细胞出现K+通道，但是由于没有提供对照组的信息我们不知道这是否是诱导的结果。Tholpady[29]等人于2003年报道了他们的诱导方法。首先用DMEM+1mmol/Lβ-ME+20% FBS进行预导，再用DMEM+ 5mmol/Lβ-ME进行诱导。诱导5天后ADASc可以检测到NF-M，Tau的表达。直到最近，没有任何一个关于ADASc向神经元样细胞分化潜能的研究报道诱导后的细胞可以表达成熟神经细胞的标志物或者可以进行复杂的神经电生理活动。2004年Safford[26]等人报道了他们对Balb/C小鼠脂肪组织来源的基质细胞诱导向神经元样细胞分化的深入研究。诱导分化后的ADASc表达Nestin， GFAP， S-100， NeuN， MAP2， tau，β-Ⅲ微管蛋白，谷氨酸受体的亚单位NR-1和NR-2，同时他们诱导后的ADAS细胞还发现有γ-氨基丁酸（GABA），突触蛋白I（Synapsin I），生长相关蛋白-43 (GAP-43)，多巴脱羧酶（DDC）， 酪氨酸羟化酶（TH）， 5-羟色氨酸（5-HTP）的分泌。他们还发现如果置换诱导剂为原来的基础培养基（alpha-MEM和10% FBS）细胞的形态将恢复至原来未诱导的状态。Fujimura[30]等人于2005年报道了研究结果。他们使用的诱导剂主要有DMEM，IBMX，胰岛素和吲哚美辛。他们发现诱导后的细胞可以表达Nestin， NSE， GFAP， IF-M，这些结果与以前学者们的报道一致。他们还进行了电子显微镜观察，发现诱导后的细胞在胞体和细胞突起的部位可以见到许多微管，表面这些诱导后的细胞已经具有神经方向细胞的结构。
在国内，2002年始有研究ADASc向神经元样细胞分化潜能的报道。杨立业[6, 31]等人已成功诱导大鼠ADASc分化为神经样细胞。此外，郑汉巧[32]等人也报道了诱导大鼠ADASc分化为神经样细胞的研究。
总结以上报道目前将ADASc诱导向神经元样细胞分化的诱导剂主要有以下几种成分: (l)抗氧化剂(β-巯基乙醇、丁羟茴醚) [8, 17, 29]和过氧化物酶体增生物激活受体γ配基（吲哚美辛）[8, 10, 30]；(2) 磷酸二酯酶抑制剂，提高细胞内cAMP的物质(IBMX、福斯高林、胰岛素) [8, 10, 15, 17, 26, 30]；(3)生长因子EGF、BDNF等[20];（4）糖皮质激素受体激动剂（氢化可的松等）[8, 15, 26]。
最近有些学者对成体干细胞向神经元样细胞分化提出了质疑，其主要原因就是细胞融合现象的发现[33, 34]，张宏伟[35]等人的研究证实了这种质疑是错误的。另Lu和Neuhuber等人[36, 37]对成体干细胞诱导后出现神经方向细胞标志物解释说我们使用诱导方法时使得原来细胞的胞体回缩，从而使胞体内蛋白浓度增高，某些蛋白可能在诱导前由于检测方法的敏感性问题检测是阴性，而在诱导后检测是阳性。这一质疑目前正处于研究之中。
3.2 体内研究
2003年Kang[20]等人报道了将huADASc移植到中脑动脉闭塞的动物模型中进行研究，发现这些细胞可以移动到缺学损伤区而同时没有引起机体的免疫抑制反应。他们用腺病毒载体将 Lac Z转入培养的huADASc内，再将这些被转染的细胞注射到动物模型中，大约有2%的细胞被发现在大脑切片中，越靠近神经组织损伤区域，我们就发现越多的移植细胞。大脑切片染色时大约有4%的移植细胞MAP2染色阳性，9%的移植细胞GFAP染色阳性，同时他们的研究表明移植到脑部的huADASc有促进脑卒中后的功能恢复。
4. ADASc的应用前景和需要解决的问题
细胞治疗和组织工程为临床治疗提供了广阔的前景，但是离广泛用于临床还有一定的距离。科学工作者已经在体外进行了广泛的分离培养成体脂肪组织来源的基质细胞，许多的研究已经表明脂肪组织中存在成体干细胞，而且也有部分报道表明ADASc有向神经细胞分化的潜能，在动物体进行移植治疗实验也有报道。但是进一步研究需要确定ADASc向神经细胞分化的体外神经生理学和神经化学信号物质转导，以及应用于神经疾病动物模型后的效果研究？从而为ADAS应用于临床治疗脑缺血性疾病，中枢或者外周神经系统损伤，多发性硬化等疾病提供实验基础。
随着细胞治疗和组织工程学的迅速发展，ADASc的研究也会更加深入，促进、支持ADASc生长分化成熟的各种生物因子，模拟体内微环境的细胞外基质等均将成为研究热点，并将取得重大突破，为ADASc成为现代组织工程学研究的理想种子细胞和最终用于以细胞为基础的神经系统疾病治疗提供前提和保障。
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