Cystatin C诊断肾进展(原创)

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摘要  Cystatin C一种存在于人体细胞外液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是一种肾小球滤过率的评价指标，其敏感性和特异性优于血清肌酐、内生肌酐清除率，Cystatin C也是胸膜疾病、HCCAA以及其他一些疾病的一种新颖的病因学诊断指标。
关键词  胱蛋白酶抑制剂C   肾功能损害   应用   进展

Abstract  Cystatin C is a cysteine proteinase inhibitor with widespread distribution in human biological fluids. Cystatin C is superior to serum creatinine and creatinine clearance rate as a sensitive and specific marker of glomerular filtration rate. Cystatin C also as a novel diagnostic aid in pleural diseases,HCCAA and other diseases of different aetiologies.  
Keyword  Cystatin C  renal dysfunction  apply  progress

一  肾功能损害的常用测定指标
肾小球的主要功能是滤过作用，临床上常用的测定肾小球滤过功能的指标有血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、内生肌酐清除率(Ccr)、血β2-微球蛋白(β2-M)，视黄醇结合蛋白(RBP)，这些指标虽然在临床上广泛应用，但它们仍有一定的局限性，且常受一些肾性和肾外因素的影响，如BUN在肾小球功能轻度受损时可无变化，且受蛋白质摄入量和体内蛋白质分解代谢的影响；Scr也不能作为肾脏损害的早期指标，其水平受肌肉量，肉食的摄入量和体内代谢水平的影响；Ccr是反映肾小球滤过功能的敏感指标，当Ccr下降到80%以下时，Scr和BUN可正常，但肾小管分泌少量肌酐，会使测定结果偏高，在病理状态下其生成速度也会增快，使测定结果不准确。近年来，同位素标记物清除率的测定方法已被广泛使用，但由于放射缘故，使其临床应用受限。国外报道较多的有非粒子造影剂iohexol（碘海醇）血浆清除率测定，其准确性和同位素相当，是目前较理想的方法，但以上方法需要留取尿液，并且价格昂贵，需要一定的仪器设备，难以作为常规测定指标。

二  一种新的肾功能测定指标—— Cystatin C
Cystatin C（胱蛋白酶抑制剂C）是一种非糖基化的碱性蛋白质，主要分布于细胞外液中，脑脊液中浓度最高，尿中的浓度最低。它含有120个氨基酸，分子量是13359Da，人体所有的有核细胞都可以持续的产生Cystatin C。其产量不受其他因素（如年龄、性别、饮食、炎症等）的影响。肾脏是Cystatin C的主要分解代谢器官，低分子量和高等电点（PI=9.3）使其能自由的通过肾小球基底膜，而且在近端肾小管几乎全部被重吸收和分解代谢(Lofberg and Grubb,1979)。
Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一种，在肽链C端有两个二硫键。Cystatin C基因属看家基因，它在人体组织中能被稳定的表达。Cystatin C的一些基因型和其基因的多态性与某些肿瘤的发生有关，因此，Cystatin C不仅可以作为判断GFR的分子指标，也可以作为癌症病人潜在的GFR的分子指标，并且不受化疗的影响(Shiraishi et al,1998)。

三  Cystatin C与其他指标的比较
    Crubb等人(1995)将51cr-EDTA测定的GFR与血清Cystatin C和Scr相比较，其相关系数（r）分别为0.77和0.75。Bokenkamp等人(1998)将菊粉测定GFR的与血Cystatin C和Scr比较，r分别是0.88和0.72，Nilsson-Ehle等人(1999)用碘海醇法测GFR与血Cystatin C与Scr，r分别是0.87和0.71，以上研究表明Cystatin C与GFR比Scr与GFR有更好的相关性。李玉林等人(2001)用乳胶增强的免疫散射法测Cystatin C，还分别测了Scr和Ccr，并比较了他们之间的相关性，结果发现血清Cystatin C与Scr有显著正线性相关（P<0.001），与Ccr的对数值呈显著负线性相关：LogCystatin C=-0.606LogCcr+1.209(y=-0.887)；沈清等(2002)用ELISA法测Cystatin C，并分析各指标之间的相关性发现，血清Cystatin C与Ccr呈显著负相关（r=-0.774），血清Cystatin C与Scr呈显著正相关（r=0.709），Scr与Ccr呈显著负相关（r=-0.674），血清Cystatin C与Ccr的相关性高于Scr与Ccr的相关性。

四  Cystatin C 诊断肾功能损害的敏感性和特异性
Risch等（1999）对30例曾行肾移植现处于稳定状态者（男女各半）检测其血清Cystatin C、Scr、Ccr、B2-微球蛋白，发现Cystatin C和GFR的相关性最好（r=0.83），Scr(r=0.67)、Ccr(r=0.57)和β2-微球蛋白(r=0.58)均不如Cystatin C；Hamoinen等（1998）采用粒子增强比浊免疫法测47例非胰岛素依赖型糖尿病病人的Cystatin C、Scr、Ccr ，相关曲线(ROC)分析表明，Cystatin C诊断的灵敏度明显高于Scr、Ccr，Cystatin C最好的诊断率（98%）时其截断点应设在1.32mg/L；Stabuc等（1998）对癌症化疗病人进行早期肾损伤检测，发现Cystatin C和Ccr有很大的相关性， Cystatin C比Ccr更敏感（r=0.84,P=0.01），如果以1.33mg/L的Cystatin C为截断点，检测小于78ml/ Cystatin C min的Ccr时，Cystatin C的灵敏度为87%，特异性为100%，回归分析表明，检测Cystatin C比Ccr更好。
沈清等人（2002）用ELISA法分析185例不同程度的肾病患者（按Ccr值分组）发现，Ccr小于80ml/min的患者中，93%的患者Cystatin C高于正常，而84%的患者Scr高于正常，Ccr在50~79ml/min之间的病人组中，77%的Cystatin C高于正常，58%的Scr高于正常，Ccr在25~49之间的患者中，有100%的患者Cystatin C高于正常，而只有87%的病人Scr高于正常，在Ccr高于80ml/min的病人中，有95%的Cystatin C在正常范围内，有100%的病人Scr在正常范围。由此发现，Cystatin C对肾功能损害，尤其是早期肾损的病人，比Scr更敏感。李玉林等人（2001）分析不同年龄不同性别的患者发现，Cystatin C在男性组和女性组不同年龄间无显著差异（P>0.05），对Ccr异常的患者，Cystatin C比Scr有更显著的符合率。
由此可见，Cystatin C在诊断肾功能损害上有以下特点：1）有稳定的生成速度，不受年龄、性别、和其他病理状态的影响；2）能自由地被肾小球滤过；3）不被肾小管重吸收和分泌。

五  Cystatin C的测定方法
自从1961年Clausen等人在脑脊液中发现Cystatin C后，许多学者致力于寻找一种更快速、更准确的Cystatin C测定方法，1979年Lofberg和Grubb提出了酶放大免疫扩散法，这种方法比较繁琐，不适用大批量测定。随后，随着各种免疫方法的不断完善，1993年Colle等人提出了酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA 法是一种定量检测Cystatin C的方法，它以包被固相载体的兔特异性多克隆抗体为第一抗体，加入待测血清后，再加入辣根过氧化物酶标记的鼠抗人Cystatin C的第二抗体，孵育后加入发光基质底物，450nm处显色。该方法大大提高了Cystatin C检测的灵敏度，其最低可测限为0.02nmol/L，分析时间需要4.5小时。1995年Kyhsen-Audersen等人提出的粒子增强比浊法使Cystatin C测定更上了一个台阶，其分析时间缩短到10分钟，在浓度为1.5mg/L时，其精确度为批内平均CV=2.6%，批间平均CV=6.6%，在浓度为5.8mg/L时，批内平均CV=0.9%，批间平均CV=3.2%。最近，德灵公司又提出了乳胶增强的散射免疫比浊法测Cystatin C，它是以多克隆兔抗体为基础的改良免疫比浊分析法，它以人尿中纯的Cystatin C定标，血清和肝素抗凝血浆均可用，整个分析过程只需要6分钟，测定范围为0.87~4.63mg/L，在浓度为0.25~7.90mg/L范围内，批内CV小于1.8%，批间CV小于1.8%。在整个测定范围内，理论值与实际值有良好的相关性。

六  Cystatin C的临床应用新进展

1        在HCCAA病因学研究中的应用
HCCAA（遗传性胱蛋白酶抑制剂C淀粉样蛋白沉积性血管病）是一种常染色体显性遗传病，由于脑动脉内淀粉状蛋白纤维沉积，引起颅内反复出血，导致中风、精神错乱、甚至死亡。HCCAA的发病机制至今还不是十分清楚，最近有研究发现，HCCAA的发病与Cystatin C的基因突变紧密相关，Bjarni等人(2002)测定HCCAA患者脑脊液中Cystatin C水平并与健康人对照发现，HCCAA患者脑脊液中Cystatin C浓度仅为健康人的1/3，从HCCAA患者中分离出单核细胞进行体外培养发现，HCCAA患者单核细胞分泌Cystatin C的能力远远低于健康对照，但其细胞内Cystatin C mRNA的转录活性并没有受限，初步估计HCCAA是由于Cystatin C突变株分泌减少，甚至不分泌，从而在细胞内积聚，形成淀粉状纤维丝。通过对Cystatin C突变株基因型分析发现，Cystatin C的基因突变发生在第68个氨基酸上，由谷氨酸取代了原来的亮氨酸。进一步研究发现，Cystatin C突变株不仅有Leu变为Gln，且其N端有10个氨基酸被截断，这可能是脑动脉内淀粉状纤维丝沉积的又一个因素，还需要进一步研究。

2        在胸膜疾病病因学研究中的应用
引起胸膜疾病导致胸腔积液的原因很多，急性或慢性肾病造成肾功能损害是发生胸膜疾病的一个主要因素，有研究表明，尿毒症患者往往因体液免疫和细胞免疫减弱，导致胸膜性肺炎。长期作腹膜透析和血液透析的患者也会发生各种胸膜疾病。但究其发病根源，却没有一种更快速敏感的指标，Cystatin C是最近才发现的一种新颖的胸膜疾病病因学诊断指标，Walfgang等人（2002）测定47例患者（其中17例肾功能损害、11例肝硬化、8例充血性心衰、6例转移癌、其他为不明原因的胸水）胸水和血液中的Cystatin C、B2-M、磷酸盐、肌酐以及总蛋白，并计算血清Cystatin C/胸水Cystatin C值。结果发现，仅在肾功能损害的患者组中，Cystatin C与胸水Cystatin C浓度接近，其比值约为1.0，其他组中，若血清Cystatin C高，胸水Cystatin C就比较低，胸水Cystatin C高，血清Cystatin C则比较低。该发现第一次由Walfgang等人报道，其研究还有待深入。

3        在动脉硬化和大动脉瘤病因学研究中的应用
人类动脉硬化和腹部大动脉瘤的发病机制来源于弹性薄层的分解，弹性半胱氨酸蛋白酶S和K，它们在动脉弹性蛋白损害部位超量表达。有人研究发现，动脉硬化和大动脉瘤患者体内缺乏Cystatin C，并且通过B超发现，腹部动脉瘤直径越大，血清Cystatin C浓度越低，体外实验发现，细胞分裂刺激血管平滑肌细胞分泌组织蛋白酶，但是TGF-beta治疗，诱导Cystatin C分泌时，组织蛋白酶弹性作用受阻。这些表明动脉硬化和腹部大动脉瘤是由于半胱氨酸蛋白酶和Cystatin C不平衡最终导致Cystatin C缺乏。

4        其他应用
Cimerman等人发现哮喘病人血清Cystatin C浓度明显提高，提示Cystatin C可能与哮喘的发病机制有关，甲基强的松可使血清Cystatin C升高，而环胞霉素A可能使Cystatin C浓度降低。
Cox等人研究恶性黑色素瘤时发现，构建的Cystatin C真核表达载体经转染恶性黑色素瘤细胞素B16后，改变B16的体外生长状态及经尾静脉注射后的小鼠肺部肿瘤的形成率。Cystatin C蛋白活性下降很可能与癌症的早期局部浸润和远端转移有关。
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