新方法可对活体细胞蛋白进行计数

chemytwei

要真正理解细胞系统的生化过程，内源蛋白的浓度大小就必须知道。最近，研究者通过荧光融合蛋白定量测量法，成功解决了内源蛋白浓度的测量问题。

   目前，由于人们对细胞内工作机制的了解日益加深，因此开发活体细胞中有关生化过程和物质结构的工具和技术也就有了基础。研究细胞系统的生物化学过程的一个关键因素就是要知道参与的生物分子的浓度大小，但令人奇怪的是，这一定量信息并不容易获得。“生物体的任何变化都是复杂的化学和物理过程，因此发生在生物体的任何反应活动都取决于反应物的浓度大小，”耶鲁大学的Thomas Pollard认为，“但是，并没有足够多的细胞生物学家对定量测量问题给予足够的关注。”

   Pollard和博士后武建秋希望上述情况能有所改变，他们同时提供了一种能测量活体细胞中内源蛋白的全细胞浓度和局部浓度的方法。虽然免疫印迹技术已经被用来测量细胞中蛋白的拷贝数，但是这种方法并不能用于局部浓度的测量。荧光反应可有效显示物质的局部浓度，但是很少有研究者愿意不辞劳苦地去从事细胞中标记蛋白的荧光反应校准工作。Pollard说：“随便翻开一本生物学期刊，你会发现里面充斥着各种漂亮的荧光融合蛋白的图片，但很少有人能够从这些图片中获得任何的定量信息。”

   武建秋和Pollard在工作中使用了裂殖酵母作为实验对象。他们根据同源重组原理，通过内源启动子表达，将一种荧光融合蛋白替代了原有的内源蛋白。由于对胞质分裂的机制特别感兴趣，他们就将黄色荧光蛋白(YFP)在27个不同胞质分裂蛋白的氨基或羧基端整合到基因组中。他们仔细对细胞进行了检测，以确保YFP融合并没有实质性地改变内源蛋白的功能或表达。使用共焦点显微法和定量免疫印迹技术，他们校准了每个YPF分子的荧光强度，过去他们用它来计算一个活体细胞中荧光融合蛋白的数量。最后，他们得出了胞质分裂中各种蛋白的浓度大小，范围从每一细胞的600个拷贝到每一细胞的143万个拷贝。

   甚至在像酵母这样的基因友好型的生物体中，要对被基因组编码的每一个蛋白进行标记也是不太可能的。武建秋和Pollard在研究肌动蛋白时也碰到了这样的难题，但他们找到了一个解决的办法：一个被标记的荧光融合蛋白在低水平的情况下可通过质粒进行表达，此时在不大量增加它的内源总体浓度的情况下有可能对该蛋白的移动过程进行可视化摄影。当研究那些不具有同源重组特征的生物体时，这种策略也可能被派上用场。

   尽管人们对活体生物中各种传统的生化过程已经进行了分离研究，但是，能够获得活体细胞内的定量信息仍然为生物学家提供了关于细胞系统的更为精确的图像。Pollard概括性地解释说：“今天的生物学，最终就是要把所有能收集到的定量信息综合在一起，来帮助理解诸如胞质分裂这样庞大的生命活动系统是如何进行工作的。”
  来自2005年12月《自然-方法学》