生命科学

[【资源下载】] ISSR、AFLP、SSR、RAPD等分子标记的实验原理及操作流程
    ISSR(inter-simple sequence repeat)标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

  AFLP  (Amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性)是在随机扩增多态性(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术上发展起来的DNA 多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP分析一样必须制备探针,且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比,AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究,种质资源鉴定方面的研究,构建遗传图谱等。
其基本原理是:以PCR(聚合酶链式反应)为基础,结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”,用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增),再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat, 简称SSR标记),也叫微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,长度较短,广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同,造成了SSR长度的高度变异性,由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同,但是其两端序列多是保守的单拷贝序列,因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物,通过PCR技术,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点:(1)标记数量丰富,具有较多的等位变异,广泛分布于各条染色体上;
(2)是共显性标记,呈孟德尔遗传;
(3)技术重复性好,易于操作,结果可靠。
缺点:开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息,而且引物合成费用较高。

   RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA),此技术建立于PCR基础之上,使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物,对基因组的DNA全部进行PCR扩增,以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列,因此须对每一随机引物单独进行PCR,单一引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异,经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNxxx段的多态性。




实验原理及操作流程见附件:
附件: 您需要登录才可以下载或查看附件。没有账号?注册
倒序浏览 看全部 全部回复
暂无回复,快来抢沙发
回复 收藏 分享 淘帖