基于印刷电化学芯片技术的单核苷酸多态性快速、简便检测

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基因携带着生命体重要的遗传信息。千差万别的基因造就了世界上丰富多彩的生物群体，而即使是一个物种的不同个体，也可能具有不同的基因。1986年，著名生物学家、诺贝尔奖获得者R. Dulbecco在Science杂志上率先提出“人类基因组计划”（简称HGP），旨在测定人类基因组DNA全序列[1]。该计划对生命科学研究，人类健康、疾病治疗都有着重大意义。  

  大部分疾病都和基因有着直接或间接的关系。基因和环境共同影响着人类疾病的发生。特定基因的变异可能会引起严重的遗传性疾病，也可能使人更容易发生某些慢性疾病或受传染性疾病攻击。科学家们现在认为单基因变异（single gene mutations）造成了大约6000种遗传性疾病，例如血友病、镰刀型细胞贫血症[2]。另外，易感性基因（susceptibility genes）虽然不一定引起疾病，却大大增加了个体惟患特定疾病的可能，如果结合了环境的影响就会导致疾病发生[2]。因此，如果能够找出疾病与基因的对应关系，通过基因诊断不仅能够在疾病尚未有明显症状时作出早期准确的诊断，并且预测一些疾病的发生，以便采取相应预防和干预措施做到“防患于未然”。  

  在寻找疾病与基因变异关系的研究中，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）基因图谱是一个重要的工具。单核苷酸多态性指特定的DNA序列中只有一个碱基发生了变化，例如碱基置换、缺失或插入，是最简单也最常见的DNA多态现象[2]。SNPs在人类基因组中的平均发生频率为每一千对碱基对中有一个碱基变异，由此形成的基因差异与个体惟患疾病程度，个体对治疗药物的敏感度都有着密切、稳定的关系。因此，SNPs被认为是非常好的基因标志——通过检测个体的SNPs可以预测疾病、准确诊断疾病及预测个体对治疗药物的反应，有助于制定更加有效安全的个性化治疗策略[2，3]。  

  目前常用的基因诊断方法有[4]：核酸分子杂交技术、聚合酶链反应、基因测序。具体应用于单核苷酸多态性的检测的技术很多，包括限制性内切酶酶切技术，等位基因特异性杂交技术，引物延伸法，寡核苷酸连接分析法，聚合酶链反应产物DNA测序，单链构象多态性，质谱法及异源双链技术等[5，6]。生物芯片[7，8]技术的出现及飞速发展为高通量、自动化的基因检测，包括单核苷酸多态性检测提供了可能，基因芯片成为最有潜力的基因诊断研究方法。但是以上这些方法都存在各自的局限，核酸分子杂交技术、聚合酶链反应及基因测序都是步骤非常繁琐，耗费大量时间精力，不适合大规模的基因检测；单核苷酸多态性检测的限制性内切酶酶切技术需要预先知道变异的位点，还要辅以扩增、降解、电泳、染色和图象分析等多个步骤；其它例如质谱法及基因芯片技术则因为试剂和设备昂贵，条件优化复杂也更多应用于研究。为了满足临床使用需求，开发新型、低成本又方便准确的基因诊断方法成为一个研究热点。  

  2007年3月，日本Eiichi Tamiya教授的研究小组及其合作者在英国皇家化学学会刊物Analyst上发表了他们关于使用印刷电化学芯片技术检测SNPs的最近研究成果，题为“Electrochemical DNA biosensor using a disposable electRochemical printed (DEP) chip for the detection of SNPs from unpurified PCR amplicons”[5]。该工作无疑推动了低成本、快速、便携的临床基因检测方法及装置的发展。

由于电化学检测具有灵敏、快速且设备成本低，易于携带等优点，已经成为发展临床检测方法的一个重要技术。另外，印刷电极、印刷芯片的成本低廉，非常适合发展可抛式商品化的产品。结合电化学检测和印刷芯片的优点，Eiichi Tamiya小组及其合作者开发了这种基于印刷电化学芯片的SNPs检测方法，并用于阿尔茨海默病（又称早老性痴呆症）相关基因变异的研究。他们采集了志愿者的DNA样品，并设计了多种含有疾病相关SNPs的DNA序列的引物对DNA样品进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。扩增后的DNA样品不用提纯，直接滴加到印刷电化学芯片上，DNA与作为电化学探针的氧化还原性分子结合，引起探针分子的电流值明显降低，由此可以间接检测出所结合DNA的量。如果志愿者的DNA在特定序列上的某个位置的碱基发生变异，用正常DNA序列的引物则不能扩增该DNA样品，而用含有特定SNPs的DNA序列的引物（即可以和发生变异的基因序列互补）就可以扩增DNA样品，通过电化学芯片检测DNA的扩增量就可以知道该志愿者DNA是否含有特定的基因变异。与一般基因芯片相比，该印刷电化学芯片不仅成本低廉，更重要的是避免了DNA探针固定过程——这是传统基因芯片的关键步骤，使工艺大大简化，并且制成一次性使用芯片进一步降低成本，利于商品化。Eiichi Tamiya教授的研究小组及合作者希望通过将印刷电化学芯片与DNA扩增仪进行整合，使其成为便携、易于操作的床边诊断（point－of－care tests，POCT）装置。  

  对于该项成果，英国曼彻斯特大学的基因组专家Philip Day认为：随着技术发展，扩增技术可以得到进一步改进，或者开发出无需扩增操作的芯片检测方法； Tamiya小组的研究推动了高灵敏度基因序列检测的发展。Tamiya教授称这种印刷电化学芯片成本低、响应快速且便于携带具有非常广泛的潜在应用价值，例如用于基因分析，癌症易感体质诊断，鉴别转基因有机体，甚至减少生物恐怖活动（bioterrorism）的威胁[9]。无疑随着基因诊断在临床应用的开展，低成本便携的印刷电化学芯片会大有用武之地。

  参考文献

[1] R Dulbecco，A turning point in cancer research：sequencing the human genome Science，1986，231： 1055－1056  

[2] http://genetics.gsk.com/link.htm  

[3] http://genetics.gsk.com/determin.htm#SNPs  

[4] http://eol.cn/article/20041020/3118416.shtml  

[5] M. U. Ahmed et al，Electrochemical DNA biosensor using a disposable electRochemical printed （DEP）chip for the detectioin of SNPs from unpurified PCR amplicons，Analyst，2007，132：431－438  

[6] 汪维鹏，倪坤仪，周国华，遗传，2006，28：117－126  

[7] S. P. A. Fodor et al，Multiplexed biochemical assays with biological chips，nature，1993，364：555－556  

[8] J. Petrik，Diagnostic applications of microarrays，Transfusion Medicine，2006，16：133－247  

[9] http://www.rsc.org/Publishing/Journals/cb/Volume/2007/5/genetic_ testing_at_a_snip.asp