免疫组化技术之免疫荧光法

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免疫荧光法是最早建立的免疫组织化学技术，免疫荧光法的基本原理是抗原抗体特异性结合的原理,将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。    常用的荧光素有：
①异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389，最大吸收光谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的黄绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。
    ②四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC），是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。
按照抗原抗体反应的结合步聚，免疫荧光法可分为以下三种：
   1） 直接法  用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。
2） 间接法
   先用特异性抗体与相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体）与特异性抗体相结合，形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏
    3） 补体法
   用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与之相结合，就形成了抗原一抗体一补体一抗补体荧光抗体的复合物。荧光显微镜下所见到的发出荧光的部分即是抗原所在的部位。补体法具有敏感性强的优势，同时适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记显示，在各种不同种属动物抗体的检测上为最常用的技术方法。
    4） 双重免疫荧光法
    在对同一组织细胞标本上需要检测两种抗原时，可进行双重荧光染色，即将两种特异性抗体（例如抗A和抗B）分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗明达标记发出橙红色荧光，将两将荧光抗体按适当比例混合后，加在标本上（直接法）就分别形成抗原抗体复合物，发出黄绿色荧光的即抗A抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B抗体结合的部位，这样就明确显示两种抗原的定位。