免疫标记技术

yujian623

目的
1、 熟悉酶免疫技术基本原理和方法、免疫荧光技术的基本原理。
2、 了解酶联免疫吸附实验（间接法）的基本过程及其作用。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上，然后加被测溶液，倘样品中有相应抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，加入酶的底物，在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比，可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上，然后加入被测血清，如有抗体，则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。洗涤后加底物显色，有色产物的量与抗体的量成正比。（见图5-1）
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量。
   

酶联免疫吸附实验（ELASA）
ELASA是一种用酶标记抗原或抗体，在固相反应板上进行抗原抗体反应的方法。常用于检测体液中的微量抗原和抗体，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、容易判断等优点。其检测方法、注意事项、结果分析等详见检测试剂的说明书。本实验以双抗体夹心法为例检测乙型肝炎病毒表面抗原介绍如下：
目的
要求了解试验原理，试验方法及结果分析。
实验材料
1．标本：待检人血清
2．试剂：酶标抗体（抗HBs）、HBsAg阳性对照血清、阴性对照、洗涤液、显色剂A、B，终止液
3．器材：已被抗体包被的微量反应板（48孔）、微量移液管、酶标仪等。
实验内容与方法
1．在微量反应板每孔加入待检标本50μl，设阳性、阴性对照各2孔，每孔加入阳性（或阴性）对照各1滴，并设空白对照1孔。
2．每孔加入酶结合物1滴（空白对照除外），充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟。
3．弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。
4．每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟。
5．每孔加终止液1滴，充分混匀。
6．用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
实验结果与评价
样品OD值≥2.1阴性对照平均OD值，判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算