血液中RNA提取

yujian623

先买一瓶淋巴细胞分离液,将血小心的加在分离液上面,离心,提取中间的絮状层,即为PBMC(单个核细胞),

分离淋巴细胞
操作步骤如下：
（1）严格无菌操作，采新鲜血液2ml于3.8%柠檬酸钠抗凝管；
（2）1,500rpm离心5min；
（3）在超净台内小心将上层血浆吸出，同时用等量的Hank’s液补足2ml全血体积，轻柔混匀；
（4）取4ml淋巴细胞分离液于15ml灭菌透明塑料离心管中，将2ml补足体积的抗凝血小心地加于淋巴细胞分离液液面上，3,000rpm室温离心10 min；
（5）小心收集界面上的细胞，加入到含4ml Hank’s液的离心管中轻柔混匀，漂洗细胞；
（6）1,500rpm离心5min，重复漂洗一次，沉淀即为所需的淋巴细胞。

不过提取的是PBMC,T,B细胞和DC细胞什么的都有.不过这是最简便最省钱的.
本着科学的态度,你可以用磁珠专一分离细胞,那做出来就比较好并且可信度高,当然花费也是比较高.

下面开始提取RNA了
Trizol提取RNA.
一般2ml血分离出来的淋巴细胞加1mlTRizol足够了。（如果不分离淋巴细胞，可以将鲜血13200g分离出中间的白色云雾带）
1 处理好的样本中，加入Trizol 1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。
2 加入氯仿200μl，充分颠倒混匀1min，成均一的乳糜状，离心5min。
3 将上清液小心转移到RNase-free 的1.5ml eppendorf里(离心分层后，可以吸取上层无色液体约为350μl，注意不要吸取任何中间层物质)
4 将上清层转移到一干净的离心管中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀, 将混合的样品在-20℃ 条件下孵育20 分钟以上,4℃,12,000×g 离心10 分钟。RNA 沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。
5 弃去上清,用冰浴的75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次,按每1ml 的BIOZOL 至少加
1ml 的75%乙醇的比例加入75%乙醇。颠倒洗涤离心管管壁,并旋涡振荡样品,尽可
能让沉淀悬浮,4℃,12,000×g 离心5 分钟,再次去除上清,晾干沉淀。

RNA的纯化

[注意]:
1 所有试剂均用DEPC-处理水配制;操作中要防止RNA酶的污染, 戴手套。玻璃器皿可在烤箱中200℃烘烤2小时灭活RNA酶。
2 1.Trizol的处理标本能力一般不超过100mg,50mg一样可以.
3 匀浆要彻底,不能还看到有团块样的物质存在,裂解非常好时应该是几乎透明状的.
4 加氯仿后尽量不要剧烈振荡(更不要用涡旋),颠倒10余次即可.经对照实验,剧烈振荡的RNA提取质量很不好,容易降解.
5 吸取上清时需要小心操作,少量多次转移上清(避免吸取到蛋白),且新手做时需要保证RNA的质量,尽量不要吸取太多.一半就可以.在操作成熟后再保证数量.
6 加入的异丙醇尽量与吸取的上清量一样.离心后,小心取出上清,新手尽量不要倒出,避免把总RNA倒出.
7 加入用DEPC处理过的水配制的75%酒精,倒出酒精后,应该可以看到一点白色RNA沉淀.室温干燥的时间要掌握好,当看到白色沉淀颜色有点变透明时迅速溶解.否则太干的RNA很难溶解的.