蛋白质间研究方法

yujian623

l   双杂交和其他双成分系统

第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定

诱饵-LexA融合蛋白的构建

1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。

2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：

a.   pBait + pMW12（活化测定）

b.   pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照）

c.   pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照）

d.   pBait + pJK101（抑制/DNA结合测定）

e.   pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照）

f.   pJK101单独（抑制的阴性对照）

3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e）或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化酵母克隆。

4．制备转化子的母板。



活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析

5．从a~f的每个转化中，用无菌的平头牙签挑选约8个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的CM(Glu)-Ura-His或CM(Glu)-Ura平板上划1 cm长的线，30℃孵育过夜。

6．第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：

转化a~f：划线到CM(Glu, X-gal)-Ura和CM(Gal, X-gal)-Ura上

转化a~c：划线到CM(Glu)-Ura-His-Leu和CM(Gal)-Ura-His-Leu上

7．30℃将平板孵育到4天。

8．对抑制和激活性进行分析：

a.   对于抑制活性，在划线接菌12～24 h时观察X-gal表型。

b.   对于激活性，在划线接菌18～72 h时观察X-gal表型。

c.   在48～96 h之间观察Leu表型。

9．基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。



检测诱饵蛋白质表达

10． 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。

11． 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。

12． 转移1.5 ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞3～5 min。可见沉淀的体积2～5μl。小心倾去或吸除上清。

13． 加入50μl的2×SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。

14． 将样品从干冰或-70℃直接转到100℃，并煮沸5 min。

15． 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心5～30秒。加20～50μl样品到SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16． 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17． 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。



第二阶段：筛选一个相互作用子

转化文库

1． 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子的酵母菌落，接种于20 ml CM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30℃摇动过夜培养。

2． 稀释20 ml的过夜培养物于300 ml的CM(Glu)-Ura-His液体培养基中至OD600约为0.10～0.15。在旋转摇床上30℃摇动培养，直到OD600达到0.50左右。

3． 把培养物转移至1个250 ml的无菌离心瓶中，室温下1000～1500g（使用Sorvall GSA转子2500～3000 r/min）离心5 min。移去上清，加入30 ml无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50 ml的无菌Falcon管中。

4． 1000～1500 g（同上）离心酵母细胞5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5 ml含0.1 mol/L乙酸锂的TE(pH 7.5)中。

5． 在30个1.5 ml的无菌小离心管中分别加入1 μg的文库DNA和50μg刚刚变形的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50μl的酵母悬浮液。

6． 在每管细胞悬浮液中加入300μl含40% PEG4000和0.1 mol/L乙酸锂的无菌TE(pH 7.5)，混合（不要振荡），30℃培养30～60 min。

7． 每个试管中加入40μl DMSO，翻转混匀悬浮液，在42℃的加热块上加热10 min。

8． 转化混合物铺平板：

其中的28管用于产生转化子：把每管混合物加到24cm×24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，将细胞涂匀，将板30℃孵育至菌落出现。

剩余2管：每管取350μl混合物加到24cm×24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，30℃培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的40μl混合物用无菌的TE(pH7.5)或水做一系列的1：10稀释，每份稀释液取100μl取在100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30℃培养平板至出现菌落。



初级转化子的收获和富集

9． 通过摇动法或刮擦法收获文库。

10． 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌TE（pH7.5）或无菌水至40～45 ml，振荡或翻转试管悬浮细胞。

11． 使用台式离心机1 000~1 500g室温下离心试管5 min，弃去上清。

12． 重复步骤10和11。

13． 重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。

14． 分别转移1 ml的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70℃冻存。



相互作用蛋白的筛选

15． 解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤14），用CM(Gal-Raff)-Ura-Trp培养基按1：10稀释，30℃摇动培养酵母细胞4 h来诱导文库中GAL1启动子的转录。

16． 在适当数量的100 mmCM(Gal-Raff)-Ura-Trp-Leu dropout平板上分别培养106个细胞。

17． 30℃培养平板5天。

18． 观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。

19． 第5天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板。

20． 30℃孵育平板直到斑点/菌落形成。



阳性相互作用的初次确定：β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测

21． 测定转录活性。

22． 解释结果。

第三阶段：阳性相互作用的再次确定

阳性质粒的分离

1．从阳性菌落中制备细胞裂解物：分离少量的菌落时，将细胞在SDS中裂解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶裂解。



转化至大肠杆菌中

2．通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌DH5α或菌KC8中引入1～5μl的质粒DNA制备品，把细菌铺在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，37℃孵育过夜。

3．如果质粒DNA转入DH5α中，则进行步骤4，如果转入KC8，则：在LB/氨苄青霉素瓶板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌用基础培养基，37℃孵育过夜；从一个分离的菌落制备小量的DNA，按步骤2所述利用这些DNA转化细菌DH5α细胞。

4．从携带文库质粒的DH5α细胞制备小量的DNA。

5．通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证或确定是否重复分离到了小量的cDNAs。



阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测

6．用下面的几组质粒转化酵母株EGY48，在CM(Glu)-Ura-His平板上筛选菌落。

a.   pMW112和pBait

b.   pMW112和pRFHM-1

c.   pMW112和一个非特异性诱饵蛋白

7．2至3天后就可以使用由步骤6所得的转化酵母。使用电穿孔的方法把得自大肠杆菌KC8和DH5α的质粒引入单个的转化子a～c中。把转化混合物铺在CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30℃孵育平板直至菌落长出。

8．为每个需要检测的文库质粒制作一块CM(Glu)-Ura-His-Trp主板。9．如第2阶段步骤21所述，检测β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。

10． 分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序。



l   用GST融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白质-蛋白质相互作用

放射标记蛋白探针的制备

1．在微量离心管中制备下列反应混合物：

[γ-32P] ATP（6000 Ci/mmol）    5μl

蛋白激酶A         1 unit/μl

在谷胱甘肽琼脂糖上的GST融合蛋白  1～3μg

2×PK缓冲液         12.5μl

水            到25μl

反应混合物在37℃孵育30 min。

2．标记反应完成后，加入200μl的1×PK缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。

3．用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用20mmol/L还原型谷胱甘肽于50mmol/L Tris (pH8.0)中，将标记GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。

4．在标记反应前如果标记蛋白与GST成分分开，就将标记蛋白上用1×PK缓冲液平衡的Sephadex G-50柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。



探测膜

5．用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。

6．用碱性缓冲液完全覆盖膜并在4℃轻轻振荡清洗10min。

7．弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在4℃轻轻振荡孵育4 h过夜。

8．加入1～3μg的贮存探针（步骤3，4）到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为1～5 nmol/L，制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4℃轻轻振荡孵育4 ～5 h。

9．以适当的方式弃去放射性探针溶液。用磷酸缓冲盐溶液（含0.2% Triton X-100）完全覆盖膜，并在4℃轻轻振荡孵育10 min。重复洗涤3次。

10． 用磷酸缓冲盐溶液（含0.2% Triton X-100和100 mmol/L KCl）完全覆盖膜，并在4℃轻轻振荡洗涤10 min。重复洗涤1次。

11． 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到X光片上。