标记抗体技术

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免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。

一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体

a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）

HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为 pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为 403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。

      HRP
  DH2＋H2O2────→D＋2H2O

b. 辣根过氧化物酶标记方法
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。

二、免疫荧光标记技术

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。

常用荧光素：

  
FITC  吸收光谱490-495,发射光谱520-530nm,分子量389.4 黄绿色荧光


TMRITC  吸收光谱550, 发射光谱620,橙红色荧光
TEXAS RED  吸收光谱590-595 ,发射光谱620-630nm,分子量625.15
SITS 、、 AMC 蓝色荧光
澡红素R  花青










三、凝集素标记技术

凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等，凝集素(Ietin)是其总称。日前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力．如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。

四、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是 80 年代继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法以及免疫层析技术等。目前已广泛应用于临床诊断，尤其是在医学临床检验中的应用，如早孕、乙肝、寄生虫、性病和病毒细菌病的检测。而动物医学临床诊断方面的应用起步较晚，最近几年才偶有报道，但作为临床诊断试剂盒开发应用的还很少。该方法最大特点是单份测定、简单快速、特异敏感，像层析试纸条技术，不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。免疫胶体金层析技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。现就该技术的原理、方法和发展前景作一简要综述。

1.免疫胶体金技术原理：胶体金用于标记的原理胶体金是一种负电荷的疏水胶，靠静电粒子相互排斥作用来维持稳定的胶体体系，其颗粒散在、红色，直径从几纳米到几十纳米不等。由于不同直径的胶体金的光散射各异，所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化，这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。同时由于胶体金金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可与SPA ,IGg,毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合，从而使其成为免疫反应的优良标记物。而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银，因此在胶体金免疫测定时加入银染色液，能放大反应信号，大大增加测定的灵敏度。

胶体金颗粒带电情况        

2.免疫胶体金技术的应用现状 胶体金用于免疫学检测研究是20世纪80年代发展起来的一项新技术，Muller 等1980年应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电镜研究，Geoghegan等(1980) 和Leuvering 等（1981）应用胶体金进行了被动凝集试验，Leuvering等（1983）利用胶体金做了早孕诊断研究。进入90 年代，免疫胶体金检测试剂开始在人体医学上逐渐研发应用，目前已有数十种检测试剂在临床上应用。而动物医学方面的检测起步较晚，近几年报道的较多，已经开始引起兽医界的重视。免疫金传统方法主要应用在被动凝集试验、免疫金电镜染色法、免疫金光镜染色法和胶体金染色免疫印迹法，目前应用较多的为斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法。现就这两项技术的应用作一介绍

1)斑点免疫金渗滤法（DIGFA） 该技术主要应用微孔滤膜（NC 膜）作载体的免疫检测技术，先将抗原或抗体点于NC 膜上，封闭后加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。通过金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体NC 膜上显示出来。Moeremans 等用此法研究表明免疫胶体金斑点渗滤法比间接过氧化物酶法更敏感一些。免疫金银染色法是最敏感的方法。该法敏感性和特异性与ELISA法相比具有良好的相符性，且具有反应快、操作简便、结果易于观察等优点，标记好的诊断试剂盒可以长期保存，随时使用，更适合于基层推广应用。

2)胶体金免疫层析法（GICA）快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC 膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。周继文等（1999）建立了用胶体金标记乙肝表面抗体制成免疫层析试纸条检测血液中的乙肝表面抗原，灵敏度可达1ng/ml与酶免疫法比较，两法符合率为99.0%.

3.免疫胶体金技术的发展前景自免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，每个样品只需1-2UL,无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；层析材料主要采用国外产品，国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，金标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色。目前该技术已经在临床医学检验广泛应用，如激素（早孕、LH 等）、传染病病原的抗体和抗原（甲肝、乙肝、丙肝、爱滋病、乙脑、流感等）、性病（梅毒螺旋体抗体、淋球菌等）、细菌（结核杆菌抗体、沙门氏菌抗体等）、寄生虫（弓形虫、包虫、血吸虫、人囊虫等）、肿瘤标记物（甲胎蛋白、血清癌胚抗原等）、心血管病检测标记物（血清心肌钙蛋白等）以及大麻、吗啡、海洛因等。这已经充分显示了该技术的应用前景仍将越来越广阔。该技术在动物医学研究虽然起步较晚，但可喜的是已经有诊断试剂面市，随着该技术的不断研究和发展，必将为兽医临床诊断试剂研究提供更加快速简便、商品化自动化的新途径。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条。