ES细胞的分离培养及其应用前景展望

yujian623

摘要 ES细胞能在体外连续传代的特点和发育的全能性使其有着广泛的应用前景，近年来发展迅速，并成为生物学领域研究的热点。本文就胚胎干细胞的概念、研究概况、筛选培养、一般生物学特性、检测、影响分离培养的因素、研究中的问题以及应用前景等做了简单的概述。

关键词 ES细胞 分离培养 问题 前景展望


胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的发现为生物学及医学研究开辟了一个新的领域，其在体外稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性吸引了广大研究者的目光，并在干细胞的研究上做了大量的研究工作。目前已经成功获得了小鼠(Evens等,1981; Martin,1981；Deacon，1998)与人(Thomson等,1998; 何志旭等,2002)的ES细胞系和大鼠（Doetschman等，1988）、猪(Evans等,1990)、牛（Gibelli等，1998）、猴（Thomson等，1995）等其他多种哺乳动物的类胚胎干细胞系，并在体外诱导分化（Angelov等，1998；李永平等，2000；张仁礼等， 2001；周其锋等，2002；胡安斌等，2003；刘星霞等，2004）、转基因(李坚等,1999;龚振明等,2002;周毅等,2003)以及一些疾病动物模型的治疗方面（安沂华等，2002；林小聪等，2003；田增民等，2003）取得了一定的成绩。尽管人的胚胎干细胞研究引起了一些宗教和伦理上的争议，以治疗为目的的研究会在伦理允许的范围内继续进行，特别是在实验动物上。ES细胞是分子遗传学、发育生物学以及临床医学研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因研究等方面有着重要的意义。随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
1. 胚胎干细胞的概念与研究概况
1.1概念
胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎分离、经体外抑制分化培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化细胞,能自我复制、自我更新，在体外连续传代并保持未分化状态和发育全能性。理论上在特定条件下可分化为构成动物体的各类细胞、组织,并可构建成心、肾、肝等各种器官,具有发育成一个完整的个体的潜能。通常将从囊胚内细胞团分离的称为ES细胞，从胚胎生殖嵴分离的称为EG（embryonic germ cell）细胞，两者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似（Mclaren，1992）。早期胚胎或ES细胞在子宫外环境中发育所形成的畸胎瘤细胞（embryonic carcinoma cell,EC细胞）因与其在功能、形态和抗原上的相似性也被称为胚胎干细胞（葛秀国等，2003）。但人们为了区分通常将从桑椹胚或囊胚内细胞团分离到的称为ES细胞，另两者称为EG细胞和EC细胞。
1.2研究概况
胚胎干细胞的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是 Evens和 Kaufman （1981）首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ES细胞,其后ES细胞研究迅速发展，Doetschman等（1988）建立了仓鼠类ES细胞系； Iannaccone等（1994）建立了大鼠类ES细胞系。在非啮齿类哺乳动物上人们相继分离获得了猪、牛、羊、水貂、兔等的类ES细胞。 Thomson等（1995）从恒河猴的囊胚中分离并建立了ES类细胞系，这是第一株灵长类的ES细胞。Bongjo等（1994）分离到了人ES细胞； James Thomson（1998）建立人类胚胎干细胞系。我国的干细胞分离培养始于1987年，紧跟世界先进技术发展的步伐，在相关领域做了大量的研究（丛笑倩等，1987；胡立新等，1996；汪河海等，1997；安立龙等， 2001；李松等，2003）。尚克刚等（1999）建立了小鼠胚胎干细胞系，并获得了种系嵌合体，为国内获得小鼠胚胎干细胞种系嵌合体的首例报道。徐令、黄绍良等（1998）由体外受精胚培养到人的类ES细胞。黄绍良等（2002）从人囊胚内细胞团分离培养并建立了三株人类胚胎干细胞系，在体外分别传代至40代、32代和30代，使我国跻身于该项研究先进行列，这是我国第一株能稳定传代的中国人类胚胎干细胞系。董雅娟等（2003）帅先报道了经过10 个月体外培养筛选的牛体细胞核移植胚胎的“ntES” 细胞再克隆获得了2%的囊胚发育率，由牛的体细胞克隆胚分离获得了类ES细胞集落，为体细胞克隆胚胎干细胞的获得提供了一种途径。
2. 胚胎干细胞的体外筛选培养及其生物学特性
2.1体外筛选培养
ES细胞的分离培养简略过程如图所示：

2.1.1培养体系的准备
ES细胞的培养方法主要有：有饲养层细胞培养法和无饲养层细胞培养法两种，后者又可分为LIF辅助培养法和条件培养基培养法。几种方法各有利弊，目前使用较多的仍是有饲养层细胞培养法。
采用有饲养层细胞培养法需要先准备饲养层细胞。目前使用的饲养层细胞主要有原代小鼠胚胎成纤维细胞（primary mouse embryo fibroblast, PMEF）和已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）细胞。将超排处理或没有超排处理的雌鼠与雄鼠合笼，观察到有阴道栓的视为怀孕，于第13-14日胚龄时处死雌鼠取胚，把胎鼠的头、内脏和四肢去掉，剪碎消化后培养，即得PMEF。待细胞长满皿底后用丝裂酶素-C处理或X射线照射处理，使其失去增殖能力，即可作为饲养层细胞用于ES细胞培养。PMEF对ES细胞的抑制分化和促生长作用优于STO，但其生命期有限，不能长期传代，而且随着传代次数的增多，其分泌各种因子的能力下降，甚至丧失；也不具有耐药性，不能用于转染外源基因的胚胎干细胞的筛选。目前已有转染neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，既能保证足够量的LIF，又能用于转基因ES细胞的筛选。STO是已建成的细胞系，处理相对简单。
采用无饲养层细胞培养法要配制含有各种因子成分的培养基，能完全支持ES细胞的生长和抑制分化。培养基分LIF-辅助培养基和条件培养基。LIF-辅助培养基利用LIF能抑制 ES细胞分化的原理，通过添加LIF和其他一些促生长细胞因子维持ES细胞的生长和未分化状态。研究表明,在无饲养层培养基中添加LIF (10ng/mL)即能抑制ES细胞分化、促进细胞增殖,并形成全能性ES细胞（Aitstin，1992）。如果通过转基因技术将编码LIF的基因导入 ES细胞，则可能建立不需要依赖环境LIF即可维持连续传代而不分化的ES细胞系。采用条件培养基培养时要先用ES细胞培养基培养细胞（如大鼠心肌细胞），一段时间后收集培养基过滤冷冻备用。常用条件培养基有大鼠心肌条件培养基、BRL（Buffalo rat liver cells）条件培养基，其原理和有饲养层细胞培养法相同，利用活细胞分泌的因子促进ES细胞生长和抑制其分化，但免除了后者的三个缺点。完善的无饲养层细胞培养法是ES细胞分离培养的一个发展趋势。
2.1.2分离培养
由囊胚分离培养ES细胞时要分离ICM通常有三种方法：第一种是把获得的囊胚放于ES细胞培养体系中培养，第10-15d后胚胎发育孵出并贴壁生长，形成清晰的细胞集落将其筛选出来进行培养；第二种是用玻璃针或刀破坏胚胎透明带，然后放于培养体系中培养至形成较大的集落后再分离；另外一种是免疫外科手术法，去除透明带后，通过抗原抗体反应使滋养层细胞肿胀松散，然后吹打将其去除。从生殖嵴分离到PGCs细胞直接培养，然后在传代过程中逐步筛选。
2.1.3筛选传代
接种后一般培养2天后就能看见ES细胞小集落的出现，3-4天时逐渐增大，至6-10天时即可进行传代培养。传代时挑选集落较大、形态典型、细胞分化较少的用玻璃针或毛细玻璃管分离下来，于消化液中消化，分散细胞团。第一次传代时不要消化至单细胞，以免传代后难以形成集落；以后的传代过程中可以消化成单细胞，以分离ES细胞克隆。一旦ES细胞筛选成功就尽量不要改变培养条件，否则很容易引起分化。
2.2一般生物学特性胚胎干细胞的定义即是对其特性的概括。首先它源于胚胎细胞，却又不同于胚胎细胞，是胚胎细胞在特定的培养条件下分离筛选出来的，与胚胎细胞相比，ES细胞能在体外不断传代，并且相对稳定的增殖但不发生分化，能自我更新、自我复制，这是大量获得ES细胞并广泛应用的前提。利用这一特点，可以用于医学上的药物试验。
3 干细胞鉴定
3.1干细胞形态学鉴定 ES细胞在体外培养中,细胞形态为圆形或扁圆形,核大、浆少、核质比高，单层或多层密集堆积而形成岛状或巢状。细胞团边缘有时可见少量已分化的细胞，呈扁平上皮细胞样或梭形成纤维细胞样。形态学检测是ES细胞培养中最直观、最常用的鉴定标准，通过形态可以判断细胞的生长情况。
3.2 表面抗原检测 ES细胞及早期胚胎细胞表面有一些特定抗原，如SSEA-1、M1-22-25、 ECMA-7等。其中SSEA-1是早期胚胎细胞特异性表面抗原，是ES细胞的一个标志。用相应抗体检测抗原的存在，从而鉴定是否为ES细胞。
3.3碱性磷酸酶(AKP)活性的检测 碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高,而在已分化的细胞中活性明显降低。用固蓝KR或固绿B盐,萘酚AS-TR染色未分化干细胞后呈深蓝紫色染色。不同的动物AKP基因表达不同,小鼠种系有AKP活性,性腺体细胞无此活性。
3.4核形分析法进行检测 检测已建立的ES细胞是否具有二倍体正常的核型。将ES细胞用秋水仙素处理后胰蛋白酶消化成单细胞，再用低渗溶液处理，固定、染色，最后在油镜下观察。
3.5 体外分化实验 体外分化实验将ES细胞悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化,随培养条件和细胞密度而有所不同。常见多种类型的细胞混杂在一起。
3.6体内分化实验 是将ES细胞悬液化注射给同种动物皮下。制作切片染色可观察到瘤块类似畸胎瘤,除大量的干细胞巢和间质细胞外,还包括神经管,腺管,上皮组织,软骨和肌肉等多类型的分化细胞。
3.7 Oct-4活性检测 Oct-4基因是小鼠胚胎发育早期,生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育多能性的标志基因（Strojdk，1992）。
3.8 嵌合实验嵌合体的构件有三种方法，使用较多的使囊胚内注入法。将ES细胞注入囊胚腔后培养恢复，然后移植到同期受体子宫内使胚胎继续发育，注入的ES细胞参与胚胎发育过程，在新生个体的几乎所有组织（包括生殖系统）内都能检测到。通过嵌合可以证明ES细胞具有全能发育的潜能。
3.9核移植实验 将ES细胞的细胞核移入去核卵母细胞中，观察重构胚的发育，鉴定ES细胞核的发育全能性。
4 ES细胞分离培养中的相关因子及其作用
目前在ES细胞分离培养中常用的因子有：白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor,LIF）、干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)、碱性成纤维生长因子(basic-Fibroblast Growth Factor,bFGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、胰岛样生长因子(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1)等，除LIF外其他几种因子都是促细胞生长因子。4.1 LIF 是典型的多功能生长因子,对于细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用,与胚胎发育,神经发育和造血系统的发育有密切的联系,LIF的最显著的生物学功能是抑制胚胎干细胞的分化,维持其多能性（Saito，1992）。在体内由多种细胞分泌，是MEF对ES细胞的主要作用因子，也是各种条件培养基中的重要成分。LIF分分泌型和机质型两种，分别存在于细胞外液和细胞外基质上。研究表明0.1ng/ml的LIF即能完全抑制ES细胞的分化。
4.2 SCF 主要由肝细胞产生，一部分存在于细胞膜上，另一部分存在于周围液体中。有人认为是干细胞生长的唯一调节因子，能控制胚胎发生过程中发育不同阶段的蛋白，促进干细胞分裂。bFGF是一种多肽，广泛分布于卵巢、睾丸、胎盘、脑垂体、丘脑下部等部位，能刺激成纤维细胞和卵巢颗粒细胞等的增殖。Shamblott 等（1998）在分离克隆人ES细胞时添加了1ng/ml的bFGF。EGF是小分子多肽，主要存在于动物尿液、乳汁、汗腺中，有很强的促分裂作用，能加快细胞分裂，缩短细胞周期，对ES细胞的增殖有促进作用。IGF-1与胰岛素结构功能相似，能促进胚胎细胞DNA和蛋白质的合成，促进细胞增殖，增加细胞数。
现在发现还有一些细胞因子,尤其是白细胞介素(interleukin-6,IL-6)、抑瘤素M(onc-ostain M,OSM)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)和心肌营养因子(carditrophin-1, CT-1)等具有L1F的部分功效,在体外,L1F、CNTF、OSM可代替饲养层细胞的作用而阻止来源于内细胞团的ES细胞的分化（李丹等， 2003）。李松等（2001）研究表明，在有饲养层细胞的情况下添加细胞因子与否对ES细胞的分离影响并不显著，而在传代过程中则需要添加，添加细胞因子组平均最高传代数6.1，而未添加组仅为2.3。
抑制分化在ES细胞分离培养中非常重要，现在主要有三种方法：有饲养层培养、添加LIF培养、将LIF基因导入ES细胞培养。这三种方法在本质上是一样的，都是通过LIF的作用来达到目的；其层次却是逐渐进步的。
5.影响ES细胞分离培养的因素
5.1胚胎细胞来源与质量
胚胎细胞质量是影响胚胎干细胞分离培养的最关键因素，是内因，只有生命力旺盛的健康胚胎细胞才可能在体外培养环境下生存。目前胚胎干细胞分离主要从囊胚的 ICM和早期胚胎的生殖嵴，安立龙等（2001）研究表明，桑椹胚或囊胚质量与胚胎形成ICM的形状密切相关，优秀胚胎形成的ICM呈团状，这种ICM细胞具有全能性，分离和克隆ES细胞的成功率高；良好的胚胎形成ICM呈条状或网状，部分细胞已具有分化的趋势，分离成功率不及团状ICM高；劣等胚胎形成的ICM多呈分散状，其分离ES细胞的成功率最低。另外胚胎所处时期对分离培养也有影响，一般囊胚效果要好于桑椹胚（Strojdk，1992）,但在不同动物上的研究结果并不一样。
5.2培养方法
培养方法也是影响ES细胞分离培养的关键因素，不同的方法都有其优缺点，选用恰当的方法才能取得最好的结果，目前大多数的研究认为有饲养层细胞培养效果还是优于无饲养层细胞培养法的。饲养层细胞的主要作用就是提供促进ES细胞生长并抑制其分化的生长因子，培养效果较好，目前绝大多数ES细胞的分离培养与建系都是采用这种方法完成的。但这种方法存在以下缺点：①饲养层细胞与干细胞长在一起，不容易获得纯的ES细胞；②用丝裂酶素处理后，如果清洗不彻底，残留的丝裂酶素会影响ES细胞的增殖；③经处理后的饲养层细胞寿命缩短，共培养过程中死亡的细胞释放出的染色体可能会引起ES细胞的突变及影响正常核型的保持。为了促进ES细胞的生长又维持其未分化状态，在培养体系中还可以加入一些因子，如：促生长的干细胞生长因子（SCF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子，抑制细胞分化的白血病抑制因子（LIF）。
5.3培养基成分
培养基要有促进ES细胞生长和抑制其分化的双重作用，目前在ES细胞的培养中多采用高糖DMEM加15%的FBS做基础培养基，另外添加一些细胞因子等微量成分。安立龙等（2001）在牛的ES细胞分离培养中比较了TCM199、DMEM（高糖）和DMEM（低糖）三种培养基础培养基的效果，结果为低糖 DMEM最好，高糖DMEM次之，TCM199最差，这与胡立新等（1996）的研究结果相反，可能是不同动物的ES细胞对培养基中糖含量的要求不一样。在都同功、黄冰等（2001）的实验中用KNOCKOUT DMEM和KNOCKOUT SR代替DMEM与血清，无论有无饲养层细胞都取得了更好的培养效果，而且免除了血清中一些促分化成分的干扰。用人工合成的培养基取代天然培养基应该是一个必然的趋势。
5.4饲养层细胞
饲养层细胞的质量和来源影响ES细胞的分离培养效果，现在使用最多的是PMEF和STO。在小鼠以外的其他动物ES细胞研究中，研究者已经从同源饲养层细胞上寻找提高培养效果的方法，但使用小鼠MEF也能获得成功，相比之下并没有显出太大的优越性（Piedrahita，1990；Saito，1992）。
5.5血清质量与添加量
血清在ES细胞培养中几乎是必需的，添加量也是很大的。由于血清直接取自动物，不同批次的会因个体差异而在成分上稍有不同，另外蛋白，内毒素等一些不利于ES细胞生长的成分含量也不一样。安立龙等（2001）比较了不同批次和添加量的犊牛血清对小鼠胚胎贴壁及 ES细胞分离的影响，指出不同批次的血清对实验结果有重要影响，添加过高或过低的血清都不利于胚胎细胞的增殖和ES细胞的分离。很多研究者认为血清质量对 ES细胞分离培养效果影响很大，在一次ES细胞培养中最好使用相同的血清。如果使用血清替代品就能够解决者这一问题，都同功等（2001）的研究中使用 KNOCKOUT SR取得成功。
6. 研究中存在的问题
ES细胞研究到目前为止，存在的问题概括起来有以下几个方面：
6.1抑制分化的问题
抑制分化是ES细胞分离培养中的关键性因素，也是决定ES细胞质量和能否建系成功的重要因素。在目前对细胞分化机制仍不完全清楚的情况下抑制ES细胞分化显得比较困难，现在主要通过直接添加或者由共培养细胞分泌的一些细胞因子作用于ES细胞，从一定程度上抑制了其分化，但培养物表面总有些细胞发生分化，培养环境的稍稍改变也会引起分化。虽然获得均一未分化的ES细胞在其研究和应用中非常重要，但抑制ES细胞分化也并非像关闭一个开关那样简单。
6.2 诱导分化的问题
诱导分化看似是一个与抑制分化相反的过程，但它较后者更为复杂。诱导的关键是定向分化，获得专一类型的组织细胞。在临床治疗上通过干细胞移植来修复损伤组织是干细胞应用的一个重要途径，但就目前的研究来看直接移植ES细胞是不可行的，很容易形成瘤性组织。经过诱导后使ES细胞朝着目标组织发生分化，形成定向的组织或细胞才能用于移植，移植物要求纯度高，分化程度一致。现在已经获得人和小鼠的较稳定ES细胞系，并成功诱导获得了一些组织细胞，如神经、心肌等，但并不能控制ES细胞定向均一分化。
6.3 安全性问题
ES细胞应用的安全性问题主要表现在两个方面：一是，移植后效果不稳定，治疗重复性差，目前的研究认为ES细胞移植前的培养和处理对治疗效果有重要影响；二是，生物安全，转基因研究和异种重构胚的建立在人类医学研究和临床治疗上有着积极的意义，但是基于生物安全性考虑，导入的外源基因和非人类基因会带来怎样的后果现在并不清楚。现在只能从与人类相近的实验动物上获得侧面的答案。研究 ES细胞的目的就是应用，定向诱导分化为某种组织细胞是很重要的一个研究方向，现在的研究中对ES细胞的分化调控机制还不清楚，分化效率低，在分化控制上还有很多工作要做。
7 应用前景展望
目前除了小鼠和人建立了可稳定传代ES细胞系外，在其他动物上只是获得了类ES细胞系，在诱导分化等方面现在只是一些探索性的尝试，距离广泛应用还有相当的距离。ES细胞的自身生物学特点决定了其广泛的应用前景。
7.1 用ES细胞进行遗传操作的研究
在遗传学和发育生物学研究上，利用ES细胞可以对基因进行定点操作，插入或敲除某个基因，研究其对细胞分化甚至整个个体发育的影响。以ES细胞做载体，结合核移植或胚胎嵌合技术生产转基因动物是一个很重要的方面。制作生物乳腺反应器和转基因育种是转基因技术的一个重要应用，ES细胞兼有易于进行遗传操作和重构胚发育率高的优点，较以往的转基因动物生产方法效率更高。
7.2 组织工程研究
ES细胞是一种新型的种子细胞，能在体外连续稳定的传代而不改变正常的二倍体核型、未分化状态和发育的全能性，较多能干细胞和单能干细胞有着诸多优点。诱导ES细胞向某一特定组织细胞分化是胚胎干细胞研究的一个重要部分，
7.3 医学及临床治疗上的应用
应用ES细胞进行临床治疗是目前研究的一个热点，如果能完全掌握ES细胞的定向分化和转基因技术，人类的很多疾病都能得到解决。通过转基因技术治疗遗传疾病和定向分化控制修复损伤是目前干细胞在临床治疗上的两大方向，ES细胞是人类攻克顽疾梦想的寄托。
参考文献
[1]Evans M，Kaufman MH.Establishment in culture of plurpotental cells from mouse embryos [J].Nature,1981,292(9):154-156.
[2]Martin G R.Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(12):7634-7638.
[3]Deacon G.Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J].Experimental Neurology,1998,149:28-41.
[4]Thomson J A,Itskovitz-Eldor J,Shapiro S S,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,282:1145-1147.
[5]Doetschman T,Willams P.Establishment of hamster blastocyst –derive embryonic stem(ES) cells[J].Dev Biol,1988,127:224-227.
[6]Evans M J, Notarianni E, Laurie S, et, al. Derivation and preliminary characterization of pluripotent cell lines from porcine and bovine blastocysts [J].Theriogenology,1990,33(1):125-128.
[7]Gibelli B,Stice S L.Production of germ line chimeric bovine fetus from transgenic embryonic stem cells[J].Theriogenology 1998,3:241.
[8]Thomson J A,Kalishman J,Golos T G,er al.Isolation of a primate embryonic stem cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(17),7844-7848.
[9]Angelov D N,Arnhold S,Andressen C,et al.Temporospatial relationships between macroglia and microglia during in vitro differentiation of murine stem cells[J].Dev Neurosci,1998,20:42-51.
[10] 何志旭,黄绍良,李予,张清学.人胚胎干细胞系的初步建立[J].中华医学杂志,2002,82(19):1314-1318.
[11]李永平,葛坚,李树浓,钟秀凤,颜建华,李建贤,冯官光.胚胎干细胞裸鼠眼内诱导形成髓上皮瘤[J].中国病理生理学杂志,2000,16(11):1182-1184.
[12]张仁礼,李海标,黄冰,陈系古,李树浓.人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化[J].中山医科大学学报,2001,22(5):325-328.
[13]周其锋,何志旭,冯炼强,黄邵良,李树浓.胚胎干细胞体外诱导分化为CD34+造血前体细胞[J].中山医科大学学报,2002,23(5S):1-2.
[14]胡安斌,蔡继业,郑启昌,何晓云,潘运龙.胚胎干细胞向肝细胞定向诱导分化的体外实验研究[J].中华医学杂志,2003,83(18):1592-1596.
[15]郭雨霁,高英茂,邴鲁军,郝晶,李盛芳.胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化的研究[J].解剖学报,2003,34(2):165-171.
[16]刘星霞,沈柏均,李府,廖兵,时庆,侯怀水.胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件[J].山东大学学报(医学版),2004,42(1):118-122.
[17]李坚,戴旭明,杨桦,傅继梁.定点突变小鼠凝血因子IX胚胎干细胞基因打靶载体的构建[J].中华遗传学杂志,1999,16(6):356-359.
[18]龚振明,李坚,傅继梁.小鼠胚胎干细胞p16INK4基因外显子1а打靶研究[J].遗传学报,2002,29(1):21-25.
[19] 周毅,宋纯,吕冰洁,许,宋春芳.胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症[J].中华实验外科杂志,2003,20(7):611-613.
[20]安沂华，王红云，张相彤，刘暌，张亚卓，王忠诚.大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究[J].中华神经外科杂志，2002，18（01）：50-53.
[21]林小聪，杨立业，郑佳坤，惠国桢，郭礼和.神经干细胞移植治疗永久性脑缺血的实验研究[J].中华显微外科杂志，2003，26（4）：289-290.
[22]田增民,刘爽,李士月,赵全军,尹丰,郝秋星,周英.人神经干细胞临床移植治疗帕金森病[J].第二军医大学学报，2003，24（09 ）：957-959.
[24]Mclaren A Development of primordial germ cell in the mouse Andrologia [J],1992(9),24(5):243-247
[25]葛秀国,徐小明,李　勇,窦忠英.白血病抑制因子与胚胎干细胞[J].中国生物工程杂志,2003 23（12）:22-30.
[26]Bongjo A，Feng CY，Ng SC，et al.Isolation and culttre of inner cell mass from human blastocysts[J].Human Reprod,1994,9:2110.
[27]丛笑倩,姚鑫.小鼠胚胎干细胞建系过程中的核型及特性分析[J].实验生物学报,1987,20:237-251.
[28]尚克刚,胡新立,李子玉.饲养层对维持新建ES细胞系的影响[J].北京大学学报(自然科学版),1994,30(4):500-507.
[29]胡立新，尚克刚.6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定[J].北京大学学报（自然科学版），1996，32（2）：248-253.
[30]汪河海,刘红林,范必勤,宗卉,丁家桐.小鼠胚胎干细胞培养体系的建立[J].江西农业学报,1997,19(2):57-60.
[31]安立龙，杨奇，窦忠英，雷安民，杨春荣，高志敏.支持牛类胚胎干细胞发育的饲养层培养体系的建立[J].西北农业学报,2001,10(3):4-8.
[32]安立龙，高志敏，杨奇，冯秀亮，窦忠英，雷安民，杨春荣，邱怀.添加物和消化液对牛和小鼠类胚胎干细胞克隆效率的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版）,2001，29（5）：5-10.
[33]董雅娟，柏学进，李建栋，铃木达行.牛体细胞克隆类ES细胞集落的筛选及其核移植[J].遗传学报,2003,30(2):114-118.
[34]李松，窦忠英，宋文刚，华进联，张显忠，张彬彬.细胞因子对人类胚胎干细胞分离克隆的影响[J].泰山医学院学报，2003 24（2）：91-92.
[35]Strojdk R M，A method for culturing morphologically undifferentiated embryonic stem cells from porcine blastocysts,Heriogenolegy[J]1990,33:901-903.
[36]Saito T,Bovine embryonic sten cell-like culture over several passages[J].Reprod Dev Biol,1992,20(3):134-141.
Sci.USA,1998,95:13726-13731.
[38]李丹.维持胚胎干细胞不分化的信号传导机制[J].国外医学遗传学分册,2003,26（03）：131-134.
[37]Shamblott M J.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells[J].Proc. Natl. Acad.
[39]都同功，黄冰，钟女奇，邓颖青，陈系古.不同条件下培养小鼠胚胎干细胞[J].中国病理生理杂志,2001，17（2）：190-192.
[40]Piedrahita,J A,Anderson G G,Bondurant R H.Influence offeeder layer type on the efficiency of isolation of procine embryo derived cell lines[J].Theriogenology,1990,33:901-903.
[41]Saito S,Strelchenko N,Niemann H,et al.Bovene embryonic sten cell stem cell-like cell line cultured several passages[J].Development Biology, 1992,210:134-141.