血管形成和骨生长

yujian623

血管形成和骨生长
生长板区的血管形成代表一个决定骨生长速率的两个基本过程—软骨形成和骨形成—偶连的主要机制。在快速骨生长或成人骨折修复期间精确的偶连是十分重要的，而平衡的改变可能导致诸如骨关节炎和异位骨形成等病理改变。在长骨生长板的形成过程中，血管结构和软骨（体内血管组织最少的组织）形成之间有一个紧密的动态相互作用。最近的实验解释了为什么软骨和血管系统的紧密接近是相互排斥的：软骨的血管入侵是和软骨细胞凋亡相联系，因此生长板血管形成的抑制延迟软骨细胞死亡，导致生长板肥大软骨细胞数量巨增。在骨架（骨骼）的生长、发育和修复过程中的软骨细胞的重要特性导致对调节软骨细胞变异和凋亡机制的热情研究。
在脊椎动物生活史中能够发现长骨中软骨血管形成的三个不同的形态时期。第一，在胚胎发育晚期，在一个静态血管形成的过程中，血管结构从软骨膜中出来通过以前存在的软骨通道套进软骨中。第二，在出生后的快速生长期，毛细血管结构入侵长骨的生长板区。第三，在成人的生长板关闭之后，在骨受伤或诸如骨关节炎等病理条件下的骨重塑期间，血管源性的开关能够暂时打开。

静态血管形成
在胚胎发育期间，一系列导致中胚层前体细胞分化成软骨细胞的事件在胚胎肢芽区发生，该过程被称为中胚层前软骨富集。这个聚集的中胚层前体细胞的富集过程导致长骨的结构再生即“骨模”的形成。在胚胎发育时期在原始骨化中心的软骨的最初血管形成即静态血管形成，与出生后骨骼快速生长期中的血管入侵生长板是不同的。在胚胎，产生成熟的血管内皮细胞从外部的前软骨组织通过正在皮层骨中的软骨通道进入骨组织，而在出生后血管形成中，血管入侵生长板区域与血管通道形成是同时发生的。血管进入这些无血管软骨结构，在18天胚胎鼠的“骨模”中心（骨干）的软骨细胞肥大分化同时发生的。这些软骨肥大分化的区域被称作骨化的原始中心，并在后来长骨的生长板中发现。在胚胎发育时期在原始骨化中心的软骨的最初血管形成即静态血管形成，与出生后骨骼快速生长期中的血管入侵生长板是不同的。在胚胎，产生成熟的血管内皮细胞从外部的前软骨组织通过正在皮层骨中的软骨通道进入骨组织，而在出生后血管形成中，血管入侵生长板区域与血管通道形成是同时发生的。但是，在静态血管形成期的内皮细胞通过已有的通道入侵，与血管内皮生长因子 (VEGF)在进行肥大分化的软骨细胞中的表达相关。这个时空相关使得VEGF仿佛是胚胎发育期的静态血管形成的化学趋向刺激。可是，指导在原始骨化中心之前的皮层骨中的通道形成的分子事件和软骨细胞肥大化的启动仍有待研究。

血管入侵长骨生长板
在骺生长板中，一个人能从组织学上区分4个不同的软骨细胞层（图1）；最末梢区是静止软骨细胞，接着是软骨细胞增殖的扁平区。这些正在增殖的软骨细胞将脱离细胞周期，并成熟为能分泌和组织一种不同的胞外基质的圆型肥大软骨细胞。肥大软骨细胞表达高水平的碱性磷酸酶(ALP)、十型胶原蛋白和相对于增殖软骨细胞而言水平降低的二型及九型胶原蛋白。与骨关节中的横向膈临近的肥大软骨细胞终末层中的细胞倾向于凋亡性细胞死亡。来自干股骺端即肥大软骨细胞和新形成的骨基质间的区域的血管入侵该区底部的软骨。内皮细胞入侵诱导凋亡软骨细胞的终末层中血管通道的形成，这些新形成的血管为一些参与骨形成的高度特异化的细胞提供进口。这些造骨细胞替代凋亡的软骨细胞并产生骨基质，因此它们是软骨内成骨重要的细胞介质。在生长板发现的其他类型的细胞单核细胞来源的破骨细胞，在一个导致骨干形成的过程中，这些细胞参与新形成的骨基质（横枝）的去除。在青春末期达到生理骨生长的最后阶段后，长骨生长板区停止展开，肥大软骨细胞层的大小靠终末生长板的动态更新过程来维持恒定。对人来说，这个过程的特点是：每年大约25%的横膈骨和3%的皮层骨被重吸收和更新。除了软骨内骨化的过程之外，存在第二个参与头颅扁平骨的形成和往长骨及皮层骨外表面添加新骨的过程。当间叶前体细胞直接分化成骨形成成骨细胞时发生这些膜内骨化。

软骨细胞表达的促血管生成及抗血管生成因子
已发现由生长板区的软骨细胞分泌的各种各样的促血管生成及抗血管生成因子（表1）。用免疫组织化学方法研究时，在在胚胎期的人类、小鼠和鸟类软骨中的低肥大化和矿化区的软骨细胞中发现最大量表达的VEGF蛋白。在24天大的小鼠的肥大软骨细胞中发现VEGF mRNA，但在静止或正在增殖的软骨细胞中没有发现。在经典的基因敲除实验中发现的早期胚胎死亡及缺少许多这些促血管形成因子特异抑制剂阻碍了分析这些因子在长骨干股后端的血管形成过程中的相互作用。基于抑制胚胎和新生小鼠生长板中的VEGF的两个替代着手克服这些局限性。口服可溶性VEGF受体免疫黏附蛋白-1和mFlt(1-3)-IgG 可以完全阻断24天龄小鼠生长板的形成。与之同时发生的有：横隔骨形成的受损和肥大软骨细胞区域的7-10倍扩大。





Table 1. Angiogenic and anti-angiogenic factors expressed by chondrocytes in the growth plate

Angiogenic Target cell type/receptor
Growth factor effect Site of expression expression Reference

CTGF Pro Hypertrophic chondrocytes Shimo et al. 1998
Endothelial cells
IGF-1 Pro Proliferative chondrocytes Proliferative chondrocytes Joyce et al. 1991
EGF Pro Proliferating chondrocytes Tajima et al. 1994
PDGF-A Pro Mature, non-hypertrophic Hypertrophic chondrocytes, Horner et al. 1996
chondrocytes sites of vascular invasion
Transferrin Pro Hypertrophic chondrocytes Endothelial cells Carlevaro et al. 1997
Cyr61 Pro Differentiating chondrocytes NA O’Brien and Lau 1992
VEGF Pro Hypertrophic chondrocytes Endothelial cells Gerber et al. 1999
Embryonic lower Chondroclasts Carlevaro et al. 2000
hypertrophic chondrocytes Osteoblast Horner et al. 1999
Unidentified Pro Hypertrophic chondrocytes Endothelial cells Alini et al. 1996
MMP-9/gelatinaseB Pro Chondroclast Endothelial cells Vu et al. 1998
Acidic and basic FGF Pro Hypertrophic chondrocytes Hypertrophic chondrocytes Baron et al. 1994
Endothelial cells
TGF-b1 Pro/anti Chondrocytes Microvascular endothelial cells Pepper et al. 1991
TSP-1 Anti Early chondrocytes Tucker et al. 1997
TSP-3 Anti Proliferative and Tucker et al. 1997
hypertrophic chondrocytes
TIMP-1, 2 Anti Chondrocytes Endothelial cells Moses et al. 1992
Ohba et al. 1995
ChM-I Anti Chondrocytes Endothelial cells Hiraki et al. 1997
CHIAMP Anti Chondrocytes Endothelial cells Moses et al. 1990

尽管不如戏剧精彩，但是当通过Cre-LOX介导的组织特异性基因消除方法去除发育中小鼠软骨中VEGF时发现一个同样的表型。在这个系统中，软骨特异的胶原蛋白2a启动子驱动Cre-重组酶的表达。这种噬菌体来源的酶通过所谓的LOX-P位点重组来诱导VEGF敲除，而LOX-P位点是早已引入到小鼠的基因组中，并夹在VEGF基因的外显子3的两边。在胚胎17.5天时肥大细胞的数量可增加2-3倍。但是，胚胎发育晚期的研究由于在心脏组织导致VEGF 基因消除的CRE重组酶的表达引起的小鼠致死而受阻。总之，这些研究确定VEGF是毛细血管入侵、生长板形态发生和出生前后发育期间软骨重塑的主要调节剂。有意思的是，在MMP-9/明胶酶B基因存在无效突变的纯合子小鼠中发现肥大软骨细胞区的同样扩大。明胶酶B是由破软骨细胞表达的，它的功能包括诸如胶原蛋白等ECM成分的降解。明胶酶B也具有切割各种各样如IL-1b、P物质、髓磷脂基本蛋白和淀粉样 β多肽等非ECM分子。在与内皮细胞共培养的胶原蛋白胶中的肥大软骨细胞培养中，对野生型的反应中能观察到血管形成反应，但对明胶酶B软骨却没有。这表明要么明胶酶B自身有促血管形成作用，要么明胶酶B是一种促血管形成因子。VEGF表达为5种不同的异构体，其中较大的4个异构体具有将VEGF留在细胞表面的肝素结合结构域。剩下的问题是确定与VEGF相连的膜是否是一种新的明胶酶B底物，从肥大软骨细胞膜不能释放VEGF是否是导致MMP9/明胶酶B敲除小鼠中观察到的表型的分子机制。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)均由生长板中的肥大软骨细胞表达。将bFGF直接输注家兔的胫骨生长板将加速血管的入侵、生长板软骨的骨化及软骨细胞的分化。将bFGF直接输注家兔的胫骨生长板将加速血管的入侵、生长板软骨的骨化及软骨细胞的分化。肥大软骨细胞表达FGF受体，表明FGF能够以调节骨形成，通过自分泌或旁分泌的形式诱导血管形成。但是，就抗-VEGF治疗的小鼠的生长板的出生后血管形成的完全抑制表明FGF在骨形成的过程中起调节作用。
在长骨的骺生长板中的软骨细胞分泌一些诸如转化生长因子β（TGF-β1）、软骨细胞血管形成抑制因子（hCHIAMP）和软骨细胞调节蛋白1（ChM- I）等血管形成抑制剂。因为大多数传统的靶向这些基因的敲除试验导致软骨细胞肥大开始之前的早期胚胎死亡，所以在生长板区的出生后血管形成的调节作用必须用不同的方法研究。
在活动性的血管形成区，肥大软骨细胞的终末层与围绕软骨细胞的基质中的高矿化区部分重叠。这表明矿化可能触发血管入侵。但是，在这样的模型中：将出生前和新生家兔的股骨头移植到正在生长的鸡胚的尿囊膜上，血管化也发生在非钙化区，表明钙化并不是血管形成的先决条件。

肥大软骨细胞的凋亡
长骨生长板中的软骨细胞的凋亡是一件最早期描述的自发细胞死亡事件。最近，系列的断层分析表明终端的肥大软骨细胞的死亡发生在不同的形态阶段，其特点是快速的细胞聚集，在几分钟内，接着就是内皮细胞穿透进入空出的腔隙。早期已经表明软骨血管形成和终端肥大软骨细胞以核浓缩为特征的凋亡之间存在关系。对每天大约生长300mm发育中的大鼠生长板的研究表明：对每个纵列的细胞而言血管入侵可以每3小时消除一个肥大软骨细胞，或者一天8个细胞。这些描述性的研究导致两个描述隐含在骨关节中的软骨细胞死亡现象下分子机制的模型的发展。（1）至今仍未确定，来自脉管的可扩散因子入侵肥大软骨细胞的末端，诱导软骨重吸收，而通过类似途径软骨细胞凋亡。（2）凋亡与肥大分化同时发生且不需要外部刺激。支持启发性凋亡的第一个模型是这样发现的：通过口服可溶性的VEGF受体导致生长板血管形成抑制引起肥大软骨细胞层大小的巨增。第二个模型预计大量增加的肥大软骨细胞将成比例地增加软骨细胞的凋亡数目。最重要的是，当用TUNEL染色分析生长板或用电镜分析核浓缩时在抗-VEGF研究中并未发现这样的增加。
其他小组已经证实存在诸如NO供体和Fas配体等软骨细胞凋亡的直接诱导剂。除这些可扩散的因子之外，软骨细胞存活依赖于黏附和细胞-细胞黏附。有趣的是，用诸如IL-1和TNF-α刺激的人类关节软骨细胞产生高水平的NO。人类骨关节炎的关节软骨包含有凋亡细胞，并且在家兔骨关节炎实验模型中观察到软骨细胞凋亡、NO产生和胞外基质降解的严重性之间存在联系。

造骨细胞、破骨细胞和破软骨细胞
正如早期提到的一样，生长板的血管形成是一系列高度特异化的参与调节诸如造骨细胞、破骨细胞和破软骨细胞的骨生成调节的细胞建立管道。造骨细胞和破骨细胞功能之间的不平衡能导致以骨质增生或骨质减少为特征的骨骼不正常。在重塑阶段成骨细胞源性因子调节破骨细胞成熟和活化。最近发现一个这样的因子是 RANKL，又名osteoprotegerin配体(OPGL)，一种TNF相关的细胞因子能结合其受体RANK (OPG)。RANK在最终成为破骨细胞系的造血干细胞祖细胞上表达，从而调节破骨细胞的发育和活化。一些包括在转基因小鼠中过度表达可溶性伪受体osteoprotegerin (OPG)或敲除其配体的实验表明：OPGL的抑制导致破骨细胞不能成熟，从而导致在其他器官发现的发育不正常之外的严重骨骼石化。在许多 osteopenic疾病例如绝经后的骨质疏松、Paget’s病、溶骨转移类风湿性关节炎中发现破骨细胞活性增加。这些疾病的原因在于骨重吸收的增加并加重骨损伤。
.对小鼠来说，在快速生长期的系统性VEGF抑制不但抑制血管形成，而且降低生长板中破软骨细胞和成骨细胞的水平。破软骨细胞属于单核细胞系并且表达 VEGFR1。单核细胞能就VEGFR1选择性的配体而迁移，表明VEGFR1在单核细胞迁移中的作用。已发现成骨细胞能够表达VEGF两种受体，从而抗 -VEGF处理的小鼠的生长板中破软骨细胞和成骨细胞的减少能够反映受损的VEGFR信号途径，进而导致这些细胞的循环和分化受损。有趣的是：Midy 和 Ploet1994年发现VEGF对培养的成骨细胞是强有力的化学引诱剂。总之，抗-VEGF处理引起的肥大软骨细胞的聚集也能由内皮细胞源性因子的缺失所导致，诱导软骨细胞凋亡或通过干预诸如破软骨细胞的特异细胞类型的分化调节软骨细胞的重吸收。另外，生长板区的改变可能反映第二层次的事件，这是由于脉管系统的缺失导致软骨细胞不容易达到内分泌因子或特异类型细胞。

未来的研究方向
分析隐藏在病理条件下如骨关节炎和软骨发育不良观察到的软骨重吸收现象下的分子事件引起广泛的兴趣。几个候选分子如Fas-配体或NO已被证实能直接诱导肥大软骨细胞的凋亡。寻找其他直接调节肥大软骨细胞凋亡的未确定的因子正在进行之中。已有证据表明抑制参与软骨细胞重吸收的特异细胞如成骨细胞的分化，在发育的骨形成期具有复杂的作用。未来的问题是这些策略是否在受损的骨形成环境能成功。最近，有证据表明在出生后的发育期间生长板中血管形成过程的抑制深刻影响肥大软骨细胞（层）的水平。抑制VEGF的活性不但导致内皮细胞数量上的减少，而且导致软骨关节中破软骨细胞和成骨细胞的数量减少。因为成骨细胞表达VEGFR1，而破骨细胞对VEGFR1和VEGFR2呈阳性反应，所以 VEGF/VEGFR信号传导通路的活化可能有益于软骨细胞动态平衡的病理状态的模型。未来的问题是观察骨折愈合期间加强血管生成是否有益于治疗。有趣的是，最近研究表明局部给予VEGF在小鼠牵拉骨生成技术模型中增强骨生成。此外，更好了解软骨细胞分化和凋亡下的分子机制将增加我们的知识，并可能有助于对治疗骨疾病设计合理的策略。