H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法

yujian623

一）材料及试剂
1．培养基 RPMI-1640或TC199培养液
2．PHA 同形态学方法
3．小牛血清
4．3H-TdR 选用比活性为2Mci~10Mci/mg分子的制品，将1 Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100礳i/ml，于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10礳i/ml溶液。
5．3%冰醋酸
6．浓甲醛
7．30%H2O2液
8．闪烁液
PPO（2，5二苯基噁唑）           5.00g
POPOP[1,4-双(5-苯基噁唑基-2苯)]       0.30g
无水乙醇                  200.00ml
甲苯                    800.00ml
混合即可
（二）操作方法
1．培养液中按1%的体积加双抗（含青霉素1万U/ml，链霉素0.01g/ml）及肝素液（含肝素100U/ml）。用3.5%NaHCO3液调pH值为7.2~7.4，然后加灭活的小牛血清，使浓度为20%。再加PHA（50U~75U/ml），无菌分装于培养瓶内，每瓶1ml。
2．无菌操作采血，并以肝素抗凝，同时进行白细胞计数及分类计数。
3．取0.1ml抗凝血，加入到含1ml培养液的培养瓶中，每个血样接2~3个培养瓶。如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血，加入培养瓶中更好。
4．37℃培养72h，在培养结束前16h～24h，每瓶加入3H-TdR 1礳i。
5．培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml，分两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也装入离心瓶中，2 000r/min离心10min，去上清。沉淀再用3%冰醋酸洗涤一次，同样离心去上清。
6．在沉淀中加30%H2O2液一滴，85℃水浴15min，待溶液呈无色时，再加甲酸0.5ml，继续加热（85℃）30min，使沉淀物完全消化溶解。
7．将消化溶解的液体移入测样杯内，用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积少于0.1ml，加闪烁液5ml，用液体闪烁液计数器测其脉冲数。
8．第5~7步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备。即：培养结束后，将培养液移入离心管，2 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤一次、再离心。将沉淀移至滤膜上（注意将沉淀全部移入），减压抽滤，并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸（若有带色物质，用30%H2O2液脱色）和3ml无水乙醇抽滤。取出滤膜，60℃~80℃烘干，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中（贴细胞的面朝上），用液体闪烁液计数器检测。
（三）结果判定  
以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值，即为0.1ml血样的脉冲数。全血检测的脉冲数，再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。也可以刺激指数（SI）表示试验结果。为此须在培养时，设同样数量的不加PHA的对照培养瓶，试验管脉冲数与对照管脉冲数之比，即为刺激指数。

（四）注意事项
1．血样与培养基比例一般在1:10~1:30为宜。
2．培养细胞时，可放入CO2培养箱中培养，也可在普通温箱进行培养，但一定要把盖子拧紧，否则结果差别较大。
3．以SI表示结果时，一定要设置相同数量培养管的对照（即不加PHA）。而以cpm绝对值表示（cpm/106淋巴细胞）则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。
4．闪烁液的容水量很低，所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类（如无水乙醇），则可容纳少量的处理后所残留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否则将发生浑浊而无法测定。据报道，如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇（TritonX-100），其容水量可达15%，消化溶解后的样品，不必烘干，即可添加闪烁液测定。