分离病毒一点经验

yujian623

培养和分离病毒是最基本的.分离病毒一般用超离心，密度梯度离心，聚已二醇沉淀等方法，做SV40病毒方面的，介绍一个简易方法：
小规模分离SV40病毒颗粒和病毒DNA：
1)培养Vero细胞形成单层，将SV40-776标准株种毒于小方瓶中，直到细胞达到完全病变。
2)将病变的细胞刮下来，溶于500 ul的PBS中，并将其反复冻溶4次，11000rpm离心10分钟，收集上清。
3)向上清中加入0.4ug/ul的RNase 37℃孵育45分钟，加NaCI使其终浓度为1M，0℃孵育1小时，7500rpm离心10分钟，收集上清。
4)缓慢加入PEG终浓度10%（w/v）并混匀，冰孵1小时，随后7500rpm离心10分钟。去上清，将沉淀溶于50ul 10mM Tris-HCI pH8.0的溶液中。可将其在4℃储存，或被用于分离SV40的DNA。
5)加入蛋白酶K终浓度为50ug/ml，56℃孵育1小时。然后加入1，4二硫代-苏糖醇终浓度为25Mm，56℃孵育半小时。
6)用酚/氯仿进行抽提病毒DNA，随后乙醇沉淀。加入病毒储存液，-20℃保存待用。长期保存要-80℃.
结果表明此方法的全部操作可在1.5ml的小管中进行，大约需要6小时即可完成，粗略估计从一个小方瓶中能够收获大约为500ng的DNA，基本满足了一般检测的需要。
请多指正！！！！！！！！！！！！！！