中药诱导干细胞定向分化的研究进展

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干细胞(stem cell，SC) 是指具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的细胞，它能产生出表型与基因型完全相同的子细胞，是机体其它细胞的起源[1]。即干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。在特定条件下，它可分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官。按干细胞的分化潜能，可将其分为如下几类：(1)全能干细胞，具有自我更新并分化为任何类型组织细胞的能力，如受精卵和胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）；(2)多能干细胞，属分化方向已确定的干细胞，如神经干细胞(neural stem cell，NSC)、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)等；(3)定向祖细胞（committed progenitor），是多能干细胞分化的下游细胞，其分化和自我维持、自我更新能力受限，如造血祖细胞；(4)前体
细胞(precursor)，指在发育过程中较另一细胞更早期的细胞，又称专能干细胞，即只能向某一类型细胞分化，如神经前体细胞。SC作为一类既有自我更新的能力(self-renewal)，又具有多分化的潜能(multilineage differentiation)，具有非常重要的理论研究意义和临床应用价值。但是如何诱导干细胞分化成为人们所期待的组织或细胞，是目前干细胞研究领域的重要环节。近年来国内外学者[2-5]采用生长因子，如脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、碱性成纤维生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）等；抗氧化剂，如β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME）、二甲亚砜、硫代甘油等；及增加胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)等定向诱导干细胞的分化。干细胞的研究同样也为中医药现代化研究带来了新的切入点，中药对SC定向诱导分化的研究，有助于了解中药的作用机制，为中药的临床应用提供理论基础。本文就近5年来中药对SC诱导分化的研究进展作一综述。

１．中药复方诱导SC分化
中药复方是天然的组合化学库。大量的实验研究表明，很多中药复方具有良好的诱导SC分化的作用。由于NSC及ESC主要取自流产胎儿的脑组织，存在一定伦理道德问题。近年来的研究发现，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是骨髓中的另一类干细胞，具有多向分化潜能[2-4]，且取材方便，体外培养能迅速扩增，体内植入反应较弱，与宿主神经组织能良好整合并长期存活等优势[5]。目前中药诱导分化干细胞的研究以MSC为主，少数涉及到NSC、HSC等。
项鹏等[6]首次报道用含复方丹参注射液(含丹参和降香)及硫代甘油的培养基分别诱导成人MSC(human MSC，hMSC)分化，均诱导出神经元样细胞。免疫组化显示神经干细胞标志物巢蛋白（nestin）、神经元特异性标志物神经丝蛋白（neurofilament-M, NF-M）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）均阳性；而星形胶质细胞(astrocyte)标志物胶质纤维酸性蛋白（glia fiber acid protein, GFAP）阴性。虽然丹参组的细胞诱导率比硫代甘油组略低，但其细胞存活时间较长。作者推测复方丹参注射液的有效成分丹参酮或总丹酚酸的抗氧化作用可能与其定向诱导机制有关。黄慧等[7]用香丹注射液（含丹参和降香）定向诱导大鼠MSC(rat MSC，rMSC)分化为神经元样细胞，他们推测丹参的水溶性成分丹参素的抗氧化作用可能是产生定向诱导的主要原因之一。其可能机制是丹参素能抑制环核甘酸磷酸二酯酶的活力，提高胞内cAMP环核甘酸水平，后者进一步激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA）、p38ERK1/2等信号传导，最终引起神经突起发生和延长。另外，丹参素也可能通过刺激MSC产生白细胞介素而诱导或参与MSC定向分化为神经元样细胞。
武衡等[8]应用血清药理学方法证实，脑溢安（钩藤、生地黄、牡丹皮、三七、地龙等）含药血清具有促进大鼠海马NSC向神经元方向分化的作用，提高NSC分化为神经元的比率，此外尚具有促进神经细胞存活的作用。并认为脑溢安通过影响NSC的增殖、分化、移行来促进神经元再生、提高神经功能恢复水平。

2.单味中药诱导SC分化
刘金保等[9-11]采用多种单味中药(当归、人参、天麻、黄芪等)诱导rMSC ，1-3 h 后，其中大部分rMSC分化为神经元样细胞，其转化率分别为当归（74.2±3.8）％、人参（69.3±4.1）％、天麻（75.3±4.1）％、黄芪（93.7±2.3）％。在干细胞具先天属性新理论指导下，张进等[12]采用龟板水煎液体外诱导rMSC分化为NSC，但没被诱导为神经细胞。他认为中医学的“精”的内涵上与干细胞有很大的相关性，“先天之精”与干细胞的基本属性较相似，补肾法可促进干细胞之间的相互转换，并提出干细胞具先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式。

3.中药单体诱导SC分化
3.1诱导骨髓MSC分化为神经细胞
3.1.1 抗氧化剂
贾延劼等[13]首次采用中药单体黄芩甙(baicalin)诱导rMSC在体外分化成为神经细胞，多数细胞表达NSE、NF，黄芩甙与β-ME相比，虽然在早期诱导效果不如β-ME，但是长期效果优于β-ME，且细胞存活率较高。
夏文杰等[14,15]选用第5～10代的MSC以bFGF预诱导，再用丹参酮ⅡA和隐丹参酮（两者都是从中药丹参中分离提纯的二萜琨类化合物）诱导，发现大部分MSC均可转变为神经元样细胞，并有轴突和树突出现，多个神经元之间可形成网络。前者诱导的神经细胞表达NSE、NF-M，提示该细胞可能尚处于神经元前体细胞阶段；后者诱导的神经细胞表达NSE、NF-H，提示神经元趋向成熟。并推测两者的诱导机理可能与其抗氧化作用有关。
3.1.2 钙离子拮抗剂
川芎嗪是从川芎中提取的一种生物碱单体，主要成分是四甲基比嗪。川芎嗪是一种新型的钙离子拮抗剂，对中枢神经系统有镇静作用，可保护视神经，促进骨髓移植后造血重建等作用。川芎嗪可体外诱导rMSC分化为神经元样细胞，诱导后的神经元样细胞初步观察可存活5天。三七总皂苷是从五加科人参属植物三七根提取的有效成分，也是一种特异性钙离子通道阻断剂，可抑制钙离子内流，减轻脊髓和视神经损伤过程中由于钙离子内流所引起的损伤，对神经元有保护作用。两者诱导rMSC向神经元样细胞分化的作用是否与阻断钙离子通道有关，其诱导分化的机理及其信号传导通路，诱导分化后的神经元样细胞是否具有神经元的功能等问题仍有待今后进一步研究[16,17]。
3.1.3 其它
麝香多肽（musk polypeptide，Mu-p）是从天然麝香中分离提纯的一种具有抗炎作用的酸性糖蛋白。肖庆忠等[18]用含Mu-p的培养基体外定向诱导第5～10代rMSC，分化为神经元样细胞。研究中所诱导得到的神经元样细胞可在体外存活时间较长（7天后仍有约10﹪的神经元存活）。同时应用所获得的神经细胞进行了大鼠脊髓横断性损伤和大鼠帕金森病的细胞替代治疗发现其可重建相应的神经功能，证明其在体内发挥了相应的神经细胞功能因此推测研究中所获得的神经元样细胞极有可能是有功能的神经元。Mu-p的诱导机理可能与其对神经细胞生长分化和突起生长的调节作用以及其具有抗氧化、抗损伤作用有关。
绞股蓝总皂苷(gypenosides)是从葫芦科植物绞股蓝中提得的一类皂苷类化合物，具有抗肿瘤、抗突变诱变、增强机体免疫力、延缓衰老的作用，对小鼠脑皮层神经元缺糖缺氧致损伤具有保护作用。董燕湘等[19]用绞股蓝诱导rMSC分化为神经细胞，分化率达90﹪，所得的神经细胞能长期存活3周左右其形态仍保持不变，可能与绞股蓝对神经细胞的保护作用有关。并在实验中观察到rMSC培养时自发出现神经细胞，作者推测骨髓中可能存在神经干细胞。
3.2 诱导NSC分化为神经细胞
三七总皂苷在离体能够促进胎鼠皮层NSC分化为微管蛋白（Tuj-1）、NF阳性的神经元和波形蛋白（Vimentin）、GFAP阳性的胶质细胞，阳性细胞聚集成团，其组成细胞大小不等，提示它们可能还未充分成熟，处于分化的不同阶段。研究结果显示，与对照组比较三七总皂苷促进bFGF、BDNF在原代培养胎鼠皮层细胞中表达，神经营养因子对NSC的增殖分化起着重要的调控作用，并推测三七总皂苷可能通过促进胎鼠皮层NSC或前体细胞bFGF、BDNF自身合成增加（bFGF、BDNF通过自分泌或旁分泌相互作用），以满足其存活、增殖、分化和自我更新的需要[20]。
3.3 CD34＋造血干/祖细胞分化为粒系细胞、红系细胞
金锦梅等[21]报道，采用含人参皂苷（Ginsenoside,GS）的无血清培养基诱导人脐血CD34＋造血干/祖细胞分化分别向红系或粒系定向分化，不同质量浓度的GS诱导14天后，细胞表面表达CD33+ 细胞随GS的质量浓度升高而增加，GS 50 μg/ml时以CD15+ 细胞数最高。这些表面标记的变化说明GS具有诱导祖细胞分化的作用，且对粒系祖细胞的作用强于红系祖细胞。
三七皂苷（Panax Notoginosides, PNS）是五加科人参属植物的主要活性成分，有研究表明，在诱导粒细胞分化的培养体系中适宜浓度的PNS可促进人骨髓CD34+ 造血干细胞向粒系细胞定向分化。粒系表面标记CD33+ 和CD15+ 的细胞百分比均明显高于无PNS的对照组，而红系细胞则没有明显的诱导分化作用，红系细胞表面CD71+ 和G-A+ 细胞百分比与对照组无明显差别[22]。

4.评价与展望
干细胞技术无疑将推动医学界一场新的革命，而中医药要走向世界，走向现代化，无疑也需与现代生物医学新技术、新领域相结合。中药诱导SC定向分化是近年来一个新兴的研究领域，由于传统中医理论本身重整体轻微观的原因，从SC领域研究中医基础理论的工作还相对较少，使用中药诱导SC定向分化的研究工作才刚刚起步，其诱导机制有待进一步深入研究，中药有着来源广，价廉，副作用小等优势，对SC长期生长分化无毒且有利于分化后细胞活体移植。另外建立中药诱导MSC、NSC等干细胞转变为神经细胞的体外模型，对研究脑的发育和分化以及神经系统疾病的治疗也有重大价值。