DNA药物及疫苗的递送方法

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DNA可经由载体递送，也可不使用载体直接给予，即裸DNA。

1 裸DNA直接递送
裸DNA通常是指环状的质粒DNA，纯化至药用标准后可以转移至真核细胞并进行表达。直接应用裸质粒DNA的表达效果和持久性依赖于体内特定的靶细胞类型，如肌纤维细胞更新较慢，外源性DNA注射到肌肉后能表达数月之久。用裸DNA来进行遗传免疫是DNA疫苗最现代的发展之一。1990年，Wolff J A等给小鼠直接肌肉注射含乙酰氯霉素转移酶(CAT)基因的真核表达载体和RNA,发现CAT基因在肌肉中得到表达，并由此推测直接将编码抗原性物质的基因导人肌肉组织，可能与接种抗原物质一样使机体获得免疫。虽然质粒DNA带有负电荷，其分子较大，不易通过带负电荷的细胞膜，也不易经由胞饮途径进行吸收，但仍可转入癌细胞及肌肉细胞表达目的基因。质粒用作DNA疫苗，皮内或肌注给药是首选。当前正有人探索肌内注射质粒DNA以实施基因疫苗接种并把治疗性蛋白分泌到体循环，特别是当这种蛋白低水平时即有利于缓解疾病时。已进入临床阶段的一个例子是治疗性双质粒乙肝基因疫苗，它包含编码乙肝病毒主要抗原蛋白的质粒及编码人白介素（IL-2）和干扰素融合蛋白的质粒佐剂，采用肌肉注射联合电脉冲转导技术免疫接种。

裸质粒DNA疫苗的其它接种途径还有静脉注射、局部给药、鼻内给药、口服等。静脉接种成功的例子已有报道。局部给药如皮肤、呼吸道等途径的转染效率虽不高，但在一些情况下已达到较好效果，并可以在局部发挥更高水平的免疫监视效果。目前，用基因枪进行皮肤接种、经鼻、气管进行粘膜组织接种都已较为成熟。使用 PowderJectTMXR1基因递送系统将治疗乙肝的质粒DNA注射入受试者上臂皮肤，发现疫苗能够被很好地耐受。相对有针注射，喷射给药能诱导出更强烈的免疫反应，可能是由于喷射到皮肤的质粒组织减损小。口服接种途径主要见于动物实验，已有一些较理想的结果。直接经外周淋巴结导人质粒DNA似乎是一种更有效的接种方式，Kevinj Molog直接将裸DNA注射到小鼠的外周淋巴小结，结果其免疫原性增加了100－1000倍。
但从药剂学角度看，DNA不适合做药物，因为其分子量、结构变动大，在生物媒介中稳定性差，在机体中难分布，很难通过简单扩散方式进入细胞内发挥药效（如非肠道给药时，裸DNA首要的消除过程包括与血浆蛋白的结合，网状内皮系统特异细胞清除后的调理作用及血清中核酸酶的消化、灭活作用）。目前仅有少量特例如转染骨骼肌和黑素瘤细胞可以经由裸DNA完成。研究发现，注入肌肉的质粒中吸收并表达的不足0.01%。大部分质粒被胞外的核酸酶降解或从肌肉转移到淋巴系统。肌肉对质粒利用率低导致基因的低水平表达，因此导入治疗的效果有限，需增加表达水平扩展质粒的应用范围。采用适当的载体是提高表达水平的方法之一。

2 病毒载体系统
载体主要分为两大类，即病毒载体与非病毒载体。病毒载体的最大优势在于易于突破细胞膜障碍，将目的基因递呈给真核生物细胞。虽然病毒载体的转移效率较高，但也存在免疫原性、靶向性差及基因表达时间短、水平低等问题。病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体及其它如腺病毒相关病毒载体、牛痘病毒基因载体及单纯疱疹病毒载体等。逆转录病毒载体是目前应用于基因治疗最为成功的病毒载体。
深圳赛百诺基因技术有限公司研制的重组人p53腺病毒注射液世界上第一个上市的基因治疗药物，商品名今又生，外观为浅白色澄明液体。它是肿瘤的基因治疗制品，为由5型腺病毒载体DNA和人p53肿瘤抑制基因重组形成的有活性的基因工程重组腺病毒颗粒。p53基因是一种可导致DNA损伤的转录因子，可以抑制癌细胞生长。若细胞复制时检测到DNA损伤，p53立即激活相关基因对损伤进行修复而使细胞不进入细胞周期。当DNA损伤超出细胞修复能力时，p53活化使细胞凋亡。其常用的给药途径有瘤内注射、静脉注射、动脉灌注、脾内注射等。虽然直接注射的方法比灌注法简单易行，但其转基因表达的效果不如灌注的效果好，且局限于注射部位。

3 非病毒载体系统
非病毒基因载体系统的安全性较高，但基因转移效率低。主要有脂质体、纳米粒、受体介导的治疗基因载体系统等。载体可以发挥对核酸酶的保护作用，并可能促进区域特殊细胞的摄取。使用缓释颗粒状载体（如脂质体、PLGA、纳米粒和树突状细胞等）还可以达到长效作用。

3.1脂质体
美国重组DNA咨询委员会已批准非病毒载体――脂质体作为介导基因转移的方法用于临床基因治疗。脂质体载体包括阳离子脂质体、pH敏感脂质体及融合脂质体等。以下着重介绍第一种。在美国目前实施的基因治疗方案中，阳离子脂质体介导的基因传递系统占12项。载DNA的阳离子脂质体的给药途径较多，包括直接注射（如肿瘤内）、静脉注射、腹腔内、动脉内注射，脾内、粘膜（鼻、阴道、直肠）、肌内注射，皮下、透皮、皮内、视网膜下、气管内给药等。有研究表明，静脉给药是癌症、心血管及其它遗传性或非遗传性疾病基因治疗的最佳给药途径。利用阳离子脂质体，Farhood将阳离子脂类介导的基因转移至鼻上皮细胞，未见急性毒性反应。Zabner J等则完成了CFTR基因转移至鼻上皮细胞的I期临床研究，未见阳离子及其与质粒联用时的不良反应。有人将日本血细胞凝集素－阳离子脂质体混悬液经气道向大鼠肺部导入半乳糖苷酶，在各相关组织中检测到持续4周的基因表达，证明了肺基因治疗的可行性。另外，脂质系统(阳离子或非阳离子的)在皮下给药后,表现出对脑淋巴结的非特异性亲和性。其淋巴吸收量依赖于胶体的性质，在40%左右。脂质体还可用于眼部给药。通常眼内给入基因药物需进行手术，但Matsuo等将β-半乳糖苷酸基因的传媒表达物包载于TMAG/DLPC/DOPE(2∶1∶4)，DDAB/DOFE(1：12.5)，DC-胆固醇/DOPE(1∶2)为载体材料的脂质体中，滴眼即可将该基因输送到眼后部视网膜神经细胞部位。Masuda等研究了包载同样基因的脂质体不同给药途径下该基因的递送情况，结果表明局部滴用可将基因输送到视网膜神经细胞；前房内注射可输送到角膜上皮、睫状上皮、睫状体和虹膜间质、视网膜神经细胞、视网膜视上皮细胞，为某些基因缺乏疾病如先天性视网膜发育不良的基因治疗开辟了一条新路。但也有试验结果显示，与游离、裸露的质粒DNA注射相比，阳离子脂质-DNA递药未能持续显著地提高 DNA的表达。虽然DNA－脂质体静脉给药可降低DNA体内降解速率，但补体与阳离子脂质体的蛋白质结合程度可能降低转染效率，且有时导致补体活化。

3.2 纳米粒
纳米粒用作药物载体，具有许多优点，如可达到控制释放药物、靶向传递药物、保护药物以提高其体内外稳定性等等。近年来，纳米粒作为基因治疗载体也开始受到注意。纳米粒除具有脂质体载体的一般优点以外，还可以克服脂质体有时在体内稳定性差的问题，但若不进行特殊的装配和构建，其转染率较低。载DNA的纳米粒适用于皮下、肌内注射，也可以经静脉或腹腔注射、进行冠状动脉灌注等。多种细胞系中进行的研究显示，以纳米粒为载体较裸DNA的基因转移率显著提高，且由于纳米粒的缓释作用，可使基因表达时间显著延长，尤其在人和猴的肿瘤细胞株中更是如此。除应用于缓缓、控释注射给药途径以外，纳米粒在口服给药方面的研究也日渐增多，纳米粒还可以用于质粒的皮肤局部给药，借助表皮层朗格汉氏细胞，比基因枪和喷射法给药有价格低和病人易于接受的优点，但质粒可能不易透过角质层。 迄今为止，国内以纳米粒为载体介导的基因转移研究报道不多，国际上尚无用于造血干细胞基因治疗、心脏基因治疗的临床或临床前研究报道。

3.3 受体介导的治疗基因载体系统
受体介导的治疗基因转移是利用细胞表面受体特异性识别相应的配体并将其内吞的机制，将与配体结合的外源基因转移至特定类型的细胞的方法。目前已发展了多种受体介导的基因转移受体－配体系统，包括去唾液酸糖蛋白、半乳化糖蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乳糖、甘露糖及合成配体等。虽然受体介导体外(细胞)基因转染率非常高，但用于体内的结果并不十分理想。Wu等通过尾静脉注射给予Nagase大鼠配体基因复合物后发现其表达水平不足以产生治疗效果。Cao等将配体基因复合物直接用于手术切开的气管，发现基因瞬时表达，需重复使用。采用配体基因复合物，对荷瘤小鼠进行瘤周注射，取得了较好的临床效果。静脉注射时，进入血液循环系统的复合物很快被补体系统系统破坏，另外，复合物颗粒过大，难以通过小的毛细血管到达靶器官。

此外，还开发出一种保护、交互式、非凝聚(PINC)导入系统(如聚乙烯吡咯烷酮)。它可和裸质粒结合形成紧密的颗粒。PINC目前在四个临床实验中测试,目的是导入细胞因子治疗癌症或表达治疗性蛋白。经由肌肉、皮下和皮内注射的PINC质粒复合物已用于动物模型。