PCR产物的克隆

mytiantian

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。
   平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
   粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。
一、PCR产物的TA克隆
1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
2.操作步骤
⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
⑵ 10μl体积反应体系如下：
　①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。
  ②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。
⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。
⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。
二、注意事项
1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。
2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。
3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。

可是PCR产物很难把保护序列切干净，所以通常的做法是先联到T载体上，再酶切，获得较纯的片断。