细胞RNA提取Protocol

yujian623

试剂： Trizol ;氯仿；异丙醇；DEPC水；无水乙醇；

器材：DEPC水处理过的枪头、EP管

步骤：
1．  Trizol 1ml/5－10×106，加入细胞平皿里，反复吹打溶解混匀细胞(之前不必洗细胞，可减少mRNA降解)。
2．  将混匀的样品全部移至EP管，室温（15－30℃）静置5分钟。
3．  加0.2ml 氯仿/1ml Trizol盖好EP管盖，剧烈震荡15秒，室温静置2－3分钟。
4．  2－8℃（一般4℃）10500rpm/min离心15分钟。
5．  取上清0.5ml/1ml Trizol,加入0.5ml（等体积）异丙醇，室温静置10分钟。
6．  2－8℃10500rpm/min离心10分钟，弃上清。
7．  RNA沉淀用1ml 75％乙醇（750ul无水乙醇＋250ul DEPC水）洗涤，漩涡混匀。（直接放入－70℃冰箱可长期保存）
8．  2－8℃8500rpm/min离心5分钟，弃上清。
9．  空气干燥沉淀，EP管平放，管口朝向酒精灯（不要完全干燥，否则极难溶解）。
10. DEPC水溶（30ul）分装。（反复冻溶易使RNA 降解）

检测RNA 提取质量：
1．  跑DNA电泳，电泳后应为3条带。
2．  测紫外260/280，一般应大于1.7（最好在2.0左右）
3．  260值×稀释倍数＝RNA含量（ug/ml）

注意：
1．  上述试剂均为提RNA专用试剂。
2．  应带双手套用镊子夹持DEPC水处理过的枪头、EP管。
3．  取上清时应用200ul枪头分次小心吸出，切勿吸到下面白色絮状物及粉红试剂。