动物细胞裂解释放细胞全蛋白及其浓度测定的方法及保存条件

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一、概述
组织细胞在特定的物理化学条件下，释放部分或全部蛋白质，通过离心等步骤加以分离，即可获得蛋白质粗品。制备细胞裂解物是分离蛋白质的一个重要步骤，裂解细胞的方法取决于不同的实验目的与要求。Cell lysis buffer 1用于释放细胞浆蛋白，Cell lysis buffer 11用分离全细胞蛋白，本实验以Cell lysis buffer 11为细胞裂解液提取全细胞蛋白。根据蛋白质性质，测定蛋白质的方法主要有：Bradford 法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量不同，其OD595值也不同，与OD595成直线关系；Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色；紫外分光光度法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收；双缩脲法：凯氏定氮法。本实验利用考马斯亮蓝法对提取细胞全蛋白质进行定量。
二、试剂与材料
1. Cell lysis buffer 11（50mMTris-Cl, 150mM NaCl, 0.0%NaN3, 0.1%SDS, 1mM PMSF, 1%NP-40, 0.5%去氧胆酸钠）
2. 低温高速冷冻离心机
3. 电动匀浆机
4. 移液器
5. EP管
6. Tip头
7. 制冰机
8. Bovine serum albumin (BSA)
9. 生理盐水
10. 紫外分光光度计或装备有595nm滤光器酶标仪
11. 考马斯亮蓝G-250（0.01％考马斯亮蓝G-250，4.75％乙醇V/V，10％磷酸（V/V））
三、操作步骤
（一）、全细胞蛋白提取
1. 组织需用预冷的PBS洗净残血，每100mg组织加入Cell lysis buffer Ⅲ 1ml，电动匀浆机匀浆至无完整细胞结构（4℃）。
2. EP管分装，离心（12000g×20min，4℃）。
3. 上清液即为全细胞蛋白质，EP管分装后-70℃保存；部分用于蛋白质浓度测定。
（二）、蛋白质浓度测定
1. BSA标准管蛋白的配制：取1.5mlEP管6个，分别加入0.5mg/ml BSA 0 ull、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，用0.9%NaCl补足至100ul。同样方法制备样品。
2. 每管分别加入1ml考马斯亮蓝G-250，震荡片刻，室温放置2分钟。
3. 加入酶标板或比色皿进行测定，读取OD595nm，以BSA标准管蛋白建立标准曲线和相关方程式，求出被测标本的蛋白质浓度。
五、注意事项
1. 制备蛋白质时一般要求在4℃条件下操作，并加入一定的蛋白酶抑制剂，以防蛋白质降解。
2. 被检测样品的稀释度应在标准曲线范围内，所以要摸索好条件，再进行检测。