Sephadex LH-20使用

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（1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲Sephadex LH-20使用心得
一、Sephadex LH-20使用说明：
1 分离范围（球蛋白）：100-4000
  颗粒大小（μm）： 20-150
  特性/应用 ： 胆固醇，脂肪酸，激素，维他命，天然产物
  PH稳定性： 2－13
  最高流速（cm/h）    500
2 适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
3 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
4 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。
5 上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，可大；差异小，应小。
凝胶过滤的上样量一般为6－8％的床体积，我们建议初次上样量控制在3％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。（见附表“溶剂混溶性”）
6 流动相的常用溶剂为：
水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯  二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加）。
使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态装柱，动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用的流动相体系平衡、上样
7 LH-20在不同溶剂中的溶胀性能：
溶剂    溶胀体积
ml/g干胶    溶剂    溶胀体积
ml/g干胶
二甲亚砜    4.2-4.4    乙醇    3.2-3.6
吡啶    4.0-4.3    异丙醇    3.1-3.5
水    3.8-4.2    四氢呋喃    3.1-3.5
甲醇    3.7-4.2    二氯乙烷    3.5-4.0
丙醇    3.4-3.8    甲苯    1.5-1.6

8 溶剂混溶性表：

溶 剂    极性指数    折光度 ＠20℃    紫外截止波长＠1AU    沸 点(℃)    黏 度(cPoise)    水中溶解度(%W/W)
乙酸    6.2    1.372    230    118    1.26    100
丙酮    5.1    1.359    330    56    0.32    100
乙腈    5.8    1.344    190    82    0.37    100
正丁醇    4.0    1.394    254    125    0.73    0.43
氯仿    4.1    1.466    245    61    0.57    0.815
环已烷    0.2    1.426    200    81    1.00    0.01
二氯乙烷    3.5    1.444    225    84    0.79    0.81
二氯甲烷    3.1    1.424    235    41    0.44    1.6
DMF    6.4    1.431    268    155    0.92    100
DMSO    7.2    1.478    268    189    2.00    100
二氧六环    4.8    1.422    215    101    1.54    100
乙酸乙酯    4.4    1.372    260    77    0.45    8.7
乙醇    5.2    1.360    210    78    1.20    100
乙醚    2.8    1.353    220    35    0.32    6.89
正庚烷    0.0    1.387    200    98    0.39    0.0003
甲醇    5.1    1.329    205    65    0.60    100
甲乙酮    4.7    1.379    329    80    0.45    24
异丙醇    3.9    1.377    210    82    2.30    100
正丙醇    4.0    1.384    210    97    2.27    100
THF    4.0    1.407    215    65    0.55    100
二异丙醚    2.2    1.368    220    68    0.37    -
水    9.0    1.333    200    100    1.00    100
二、Sephadex LH-20使用心得谈：

1 Sephadex LH-20是一种价钱较高的填料，使用请千万注意别污染;
2 先讲Sephadex LH2-0 的原理。 Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要*凝胶过滤作用来分离。

3 再讲Sephadex LH-20 洗脱溶剂。Sephadex LH-20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH-20 堵啦，就得将Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 分离的技巧，最后说说速则不达。

（2）柱子尽可能长， Sephadex LH-20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。

（3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。

（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。

（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH-20 分鞣质
（6）Sephadex LH-20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。
三、Sephadex LH-20再生:
1 Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,

2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH-20用反相被污染，办法如下
依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。
NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水