种子蛋白质组分分析

yujian623

原理
根据清蛋白可溶于水、球蛋白溶于稀盐溶液、醇溶蛋白溶于乙醇、谷蛋白可溶于稀碱或稀酸溶液的性质，可用不同溶剂把这4 种组分从样品中分离提取出来。然后用凯氏法分别定量或利用SDS-PAGE 进行各组分亚基分析。

仪器、试剂和材料
1．仪器
( 1）日本MRK 公司产VS - KT-P 自动定氮仪
( 2）样品磨
( 3）玻璃层析柱
2．试剂
( 1 ) 50％异丙醇（V / V）或70％乙醇
( 2 ) 3％硼酸
( 3 )0.5mol / L NaCI
( 4 )0.l mol / L NaOH

操作步骤
1．制样
谷物籽粒风干，用样品磨粉碎，放干燥器中备用。
2．装柱
在玻璃层析柱底部过滤筛板上置一层滤纸。称取酸洗并经540℃ 高温处理的石英砂 60g，样品2g 装入三角瓶中混匀，每个样品重复3 次，设空白对照。另称取石英砂20g，其中10g 置于层析柱底部，将三角瓶中混合物装入柱内，再将剩余的10g 石英砂加入层析柱上部。装好后用小木棒轻轻敲打把空气排出。
3．提取
在提取前加20rnl 蒸馏水，排出柱内气体，浸湿样品，然后按下列步骤进行。
( 1）加100ml 蒸馏水调节流速为0.5ml / min，提取清蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
( 2）加100ml0.5mol / L NaCI 提取球蛋白，定容于100 ml 容量瓶中。
( 3）加100ml 70％乙醇提取醇溶蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
( 4）加100ml0.1 mol / L NaOH 提取谷蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
4．提取液中蛋白质含量测定
( 1）从每一容量瓶中吸取10ml 提取液放入消化管中（摇匀后再吸）。然后加3ml 浓浓硫酸，2.5g 催化剂。用150℃ 加热0.5h 蒸干溶剂，然后用200℃消化0.5h , 400℃ 消
化0.5h。
( 2）消化管自然冷却后，即可用自动定氮仪进行含氮量测定。
5．样品总蛋白质含量测定
每一样品称取0.2g ，重复3 次，然后按本实验I 方法用自动定氮仪测定含氮量。

结果处理
( l）计算样品中蛋白质含量。
( 2）计算各蛋白组分在样品中的含量及占总蛋白质的比率。