脲酶的动力学研究

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脲酶属于一种寡聚酶44，分子量约为483000，等电点为4.8，最适pH 7.0。脲酶的Km 值因其来源不同和测定条件不同而异，例如刀豆脲酶，用pH7.0Tris-硫酸缓冲蔽，Km 为5.1×10-3MoL／L；本实验是用大豆脲酶粗制品，pH7.0 Tris-硫酸缓冲液，25℃保温，所测Km 值约为3.0×10-3 mol/L 左右。
通过测定氨的释放速度，就可得知水解速度。文献中多采用奈氏(Nessler)试剂显色法测定所释放的氨量。其反应如下：

由于该方法手续较繁，试剂也较贵，我们只用奈氏试剂作酶活力初步鉴定，而以康维(Conway)
微量等温蒸馏定氨法测定氨量。

仪器和试剂
仪器
秒表、康维皿、细玻棒、恒温水浴、恒温箱、微量水平滴定管、吸量管。
实验原料：新鲜大豆粉
试剂
1. 30％乙醇(V／V)
2. 人造浮石：Permutite 颗粒状人造浮石。
3. 2％乙酸
4. 0.1mol/LpH7.0 Tris-硫酸缓冲液：取25mL2mol/LTris 溶液，加21mL0.1mol/L 硫酸，用水定容到50mL，检查pH。
5. 3％脲－5.4％磷酸氢二纳—4.25％磷酸二氢钾溶液
6. 奈氏(Nessler)试剂:称取5g 碘化钾，溶于5mL 蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液(100mL 水约溶解
5．7g 氯化汞)，并不断搅拌，直至产生红色沉淀不再溶解时．再加40mL50％氢氧化钠溶液，稀释至100mL，混匀，静置过夜，倾出清液贮存于棕色瓶中。
7. 0.020mol/L、0.040 mol/L、0.060mol/L、0.080 mol/L、0.10 mol/L、0.16 mol/L 脲溶液。
8. 0.1mol/L、0.4mol/L、0.8mol/LPH7.0磷酸盐缓冲液。
9. 0.1mol/L，pH5.0、pH6.0、pH7.0、PH8.0、PH9.0Tris—硫酸缓冲液。
10. 0.02 mol/L 准硫酸铵溶液
11. 微量等温蒸馏定氨所用试剂
12. 1mol/L 盐酸

操作步骤
(一)脲酶制备及活力测定
1.脲酶提取液的制备：
称取1g 人造沸石，放在小烧杯中用2％乙酸洗2次，每次约用10mL，再用蒸馏水冲洗至中性。在锥形瓶内加2g 大豆粉，1g 处理好的人造沸石(起离子交换剂作用．以除去溶液中的游离氨。)和20mL30％乙醇，在水浴中连续摇动锥形瓶15-20分钟，过滤，滤液在冰箱中可以贮存2-5周不失去脲酶活性。
2.脲酶活力鉴定：
取3支干燥试管，其中1支加入0.1mL3％脲的磷酸盐缓冲液及0.1mL 酶溶液，25℃保温10分钟，立即加入7mL 水和1mL 奈氏试剂混匀，棕红色出现表示氨的被释放，与此同时在另2支试管中以0.1mL水和0.1mL0.02mol/L 硫酸铵溶液分别代替脲溶液作空白和标准管对照。
假若样品管(脲液加酶)的颜色和标准管的颜色相近，能定性地说明脲酶提取液的酶活性较高，可供以下动力学实验用。
(二)底物浓度对脲水解速度的影响—Km 和V 的测定
取5支试管编号，按表3—21顺序加入下列溶液。

将上述试管放在25℃恒温水浴中平衡5分钟后，分别加入0.2mL 脲酶溶液(由于大豆粉新鲜程度不一样，可根据酶提取液活性大小决定加酶量，以使反应速度便于测量)，迅速混匀，记时，继续保温，在一定时间(例如第2，5，7，10，15分钟)取出0.2mL 反应液，加入已预先准备好的康维皿外室中，立即盖紧玻璃盖，使不漏气，然后迅速使样品和饱和碳酸钾溶液混合。每次取样，混合所用时间越短越好。待样品全部取完，把康维皿用线绳捆紧一起放入30℃恒温箱内，保温1小时后，取出用微量水平滴定管以0.0100mol/L 标准盐酸进行滴定。
以时间为横坐标(分钟)，盐酸滴定值(cm)为纵坐标作图，由直线的斜率求出不同底物浓度相应之初速度，再将cm/min 单位换算成氨μmoL/min。
以S/v 为纵坐标，为横坐标作图(见图小圆)，求出Km 和Vmin，图中裁距=Km/Vmin，斜率＝1/V，横抽裁距＝一Km。此处V 仅是相对值，只有知道酶溶液的蛋白质mg 数后才能求出真正的V。
(三)pH 对脲水解速度的影响
取5只试管标以记号，各加入0.5mL0.1mol/L 脲溶液，再分别加入1mL0.1mol/LPH5，pH6，pH7，pH8，pH9的Tris－硫酸缓冲液，同前法预保温5分钟后，分别加入0.5mL 酶溶液，混匀。在25℃保温10分钟，然后立即加入0.5mL 1mol/L 盐酸，混匀，将试管置于冰浴内以停止酶的反应。从每只试管取0.2mL 反应液用康维法定氨，每个样品均平行作2次。以最高活性为100％与其余PH 活性比较求出相对活性。
比活力＝X/(t×a)
a— 酶液中蛋白质数(mg)；
t—反应时间(min)；
x—氨量(moL)。
以相对活性为纵坐标，pH 为横坐标作出活性—pH 曲线，求出脲酶的最适pH。
(四)抑制剂对脲水解速度的影响
取一系列试管标号，按下表组成反应液

同前法分别在各试管中加入0.25mL 脲酶提取液，25℃保温5分钟(或10分钟)，立即从每只试管取出0.1mL 反应液，用康维法定氨，每份样品平行作2次。
(四)结果处理
以1/v 为纵坐标，1/为横坐标作图。由图可以判断出磷酸盐对脲酶的抑制类型。磷酸盐为脲酶的竞争性抑制剂。
附：康维微量等温蒸馏定氨法
一、原理
用饱和碳酸钾(强碱)溶液将样品中的氨逐出，在恒温条件下扩散至康维(conwsy)皿密闭空间中，被硼酸指示剂混合液吸收。硼酸的酸度改变引起其中指示剂的颜色变化，以标准盐酸溶液中和所吸收的氨，使指示剂恢复至原来的颜色，由消耗盐酸之量，可以计算出样品中的含氨量。其反应如下：

硼酸指示剂混合液变色范围是：pH4.26 粉红色； pH4.90

二、仪器和试剂
仪器:
制康维皿的铜制金属模具、微量水平滴定管、蜡制康维皿及玻璃盖、恒温箱。
试剂
1. 饱和碳酸钾镕液：取112g 碳酸钾加100mL 水溶解。
2. 0.0100mol/L 标准盐酸溶液：用前标定。
3. 阿拉伯胶溶液：阿拉伯胶粉:水：甘油:碳酸钾＝10:15：5:5．以重量比例混合后小火加热溶解，不断搅拌防止不均匀或局部烧焦，配好后贮存于硫酸干燥器中备用。
4. 硼酸指示剂混合液：称取1g 硼酸用水溶解，稀释至98mL，再加入2mL 混合指示剂，用稀氢氧化钠溶液调至紫红色。
混合指示剂：将33mg 溴甲酚绿及66mg 甲基红一起溶于乙醇，稀释至100mL。
5. 0.0200mol/L 标准硫酸铵溶液：精确称取0.66088分析纯硫酸铵，用水溶解后定容到500mL。
三、操作方法
(一)康维皿的结构与制造
康维皿是由玻璃、瓷或石蜡制成的浅皿，如图3—8所示。分内外两室，外室比内室高，边缘必须齐平，盖上玻璃片后与外室边缘不得有缝隙或缺口。
(二)微量水平滴定管的构造和标定
微量水平滴定管是一只粗细均匀内径约1mm 的毛细玻璃管。玻璃管前端拉尖，另一端套一小段透明橡皮管便于吸取溶液。玻璃管固定于50cm 长的标尺上用汞标定每cm 毛细管的体积简便方法如下：吸入一定量汞(约10cm 左右)，微微移动标尺，使汞在毛细管内滑动，读出等量汞在标尺前段，后段和中间时所占的cm 数，3次读数相差不得超过0.1cm，否则表明毛细管粗细不均匀，不适合使用。然后挤出汞，称重，如此重复3次取平均值。测量汞的温度，再查汞的密度表，可求出平均每cm 毛细玻璃管相当的mL 数。由于毛细管往往不均匀，最好每1cm 逐段标定。
(三)标准硫酸铵的滴定曲线
准备11个干净康维皿，在内室各加0.1mL 硼酸指示剂混合液，康维皿边缘点上一圈阿拉伯胶，外室一角加入0.5mL 饱和碳酸钾溶液．另一角按下表加入0.02mol/L 标准硫酸铵溶液。

在未盖严玻璃片前不能使饱和碳酸钾溶液与样品混合，盖玻璃片时略压紧，必须使阿拉伯胶充满维康皿与玻璃盖间的空隙。为了防止保温时玻璃盖滑开，可以将3-4个康维皿用绳捆成一叠，再拿到30℃恒温箱保温14小时，待氨释放完全后，用微量水平滴定管以0.01mol/L 标准盐酸滴定，滴定时可用玻棒搅拌内室溶液，指示剂由绿变成微红不消失，则为滴定终点。绘出硫酸铵的滴定标准曲
注意事项
1.要保证康维皿清洁，用过的康维皿先用自来水把阿拉伯胶冲洗干净，再用肥皂刷洗，放在约含0.05mol/L 硫酸溶液中浸泡2-3小时，取出，用水冲洗至中性，最后用蒸馏水冲洗，甩去水滴，放在瓷盘内晾干，切不可在温箱内烘烤，以防蜡皿变形。
2.保温使氨扩散时，谨防漏气，不能使用边缘不平的蜡皿，阿拉伯胶涂得过多则玻片易滑开，涂得过少也会漏气。
3.严防碱液溅入中央小室，加入样品和饱和碳酸钾溶液时不可吹入；滴定时渍有阿拉伯胶的玻璃棒不可放入中央小室搅拌。
4.实验室环境中不应有氨气。