植物组织培养技术

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植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。植物组织培养的过程可概括为：

茎尖、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。
植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术；了解外植体脱分化及再生的过程；理解植物细胞全能性。
一、试材与用具
1．植物材料：花生、烟草、苹果、大白菜、玉米等。
2．实验室：准备室、接种室、培养室等。
3．仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天秤、酸度计、超净工作台等。
4．器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、记号笔等。
5．玻动器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。
二、方法步骤
（一）培养基的制备
1．母液的配制
在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：①无机营养，包括大量元素和微量元素；②有机物质；③铁盐；④碳水化合物；⑤天然复合物；⑥激素；⑦琼脂（固体培养基）；⑧其他添加物。在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表2－1）。配制母液时应注意以下两个方面：
（1）配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根（SO42-）、磷酸根（PO43-）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。
（2）各类激素用量极微，其母液一般配制成0.1～1mg/ml。有些激素配制母液时不溶于水，需经加热或用少量稀酸、稀碱及95%酒精溶解后再加水定容。常用激素类的溶解方法如下：
萘乙酸（NAA）：先用热水或少量95%酒精溶解。
吲哚丁酸（IBA）：先用少量95%酒精溶解后加水，如溶解不完全再加热。
激动素（KT）、（KIA）、（6-BA）：要先溶于1N盐酸。
玉米素（ZT）、（ZEA）：先溶于95%酒精，再加热水。
2,4－D：需用1N NaOH溶解再定容。
2．培养基的配制、分装及灭菌
根据培养基的成分及用量，吸取各种母液，称取蔗糖（一般用量3%），加水至所需体积，待蔗糖全部溶解后，用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度至pH5.8，加入琼脂粉（一般6.5～8g/L），加热使琼脂完全熔化，蒸馏水补齐溶液体积，分装在三角瓶或培养瓶中，高压灭菌。不耐高温的培养基成分，需过滤灭菌。

（二）外植体取材、消毒及接种
1．取材与消毒
自大田取材或温室取材时应选取无病、无虫、生长健康的外植体。外植体表面消毒的一般程序为：外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。常用消毒剂的种类，使用浓度及消毒时间等见表2－2。

2．无菌操作
（1）接种室消毒
超净工作台面70%酒精试擦，打开紫外灯照射20分钟，进行无菌室及超净工作台杀菌。
（2）材料的接种
操作人员接种前必须剪除指甲，并用肥皂水洗手，接种前用70%酒精拭擦，接种时最好带口罩。接种时，必须在近火焰处打开培养容器的瓶口，并使瓶倾斜（瓶口低，瓶底高），以免空气中的微生物落入瓶内。
（三）无菌培养与观察
接种后期材料放入培养室或培养箱内培养，温度一般为25℃±2℃，光照10～16h，光强1000～2000勒克斯，有的材料需要暗培养。定期观察，继代培养（或转接培养）。
三、植物组织培养程序实例
（一）苹果茎尖培养
1．春季剪取5cm左右新梢茎尖，消毒后切取茎尖或带芽的茎段，接种在MS+2mg/L BA的培养基上培养诱导芽伸长。
2．把伸长的芽切段接种到MS+1mg/L BA+0.5mg/L K2N+2mg/L IAA的培养基上培养，获得丛生芽。
3．切取约2cm长的芽，浸入100mg/L IBA液体培养基中15～30min，接种在1/2MS（蔗糖20g/L）的培养基中，培养20d获得生根试管苗。
4．生根苗移出进行砂培2～3周，移入土壤中生长。
（二）大白菜侧芽培养
切取2～4mm长的腋芽，70%酒精表面消毒，10%漂白粉消毒20～30min，接种于MS+5mg/L BA+2mg/L IAA培养，侧芽伸长后转入MS+1mg/L BA+2mg/L NAA的培养基中诱导生根，形成试管苗。