Nature  Genetics：DNA复制过程中断裂频率比预计低很多

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Nature Genetics：DNA复制过程中断裂频率比预计低很多 本周《NatureGenetics》一篇文章介绍，大肠杆菌（Escherichiacoli）的DNA在复制过程中发生断裂的频率比之前推测的要低20－100倍，而且还描述了一种观察体内链断裂的新技术。萨塞克斯大学(UniversityofSussex)基因组损伤和稳定性中心AidanDoherty（未参与实验）说：我们非常幸运，研究人员几乎能够得到断裂的实际数目。SusanRosenberg实验室设

  生物谷报道：在最新一期的Nature Genetics（2007年5月27日）一篇文章中介绍，大肠杆菌（Escherichia coli）的DNA在复制过程中发生断裂的频率比之前推测的要低20－100倍，而且还描述了一种观察体内链断裂的新技术。萨塞克斯大学(University of Sussex)基因组损伤和稳定性中心Aidan Doherty（未参与实验）说：我们非常幸运，研究人员几乎能够得到断裂的实际数目。

  Susan Rosenberg实验室设计出一种新的分析检测系统，对野生型E.coli细胞进行遗传改造，使细胞在出现DNA双链断裂（DSB）时发出绿光。这种技术提供了原核细胞中实际DSB的直接数据。之前的研究推测，染色体每次复制都会出现DSB。Rosenberg与其同事认为是染色体每复制100次约出现一次DSB。如此低的断裂频率提示单个断裂在引发细胞损伤、突变和癌化时扮演的角色更重要。但Rosenberg说即便新推测的频率很低，DSB还是很常见。同源重组是E.coli偏爱的修复机制，是DNA重新结合的最温良途径，被认为是无差错方式。100次复制出现一次DSB等同于重组频率的10％，这对于推测的无差错方式来说是庞大的。

  为了直接观测细菌细胞中DSB数量，Rosenberg与同为Baylor医学院的同事Jeanine Pennington利用病毒，将编码绿色荧光蛋白的基因插入细菌基因组中。DNA复制过程中发生断裂时，细胞发动一套机制迅速修复损伤位点。按照Rosenberg的设计方案，这些机制被激活后引起细胞发荧光。

  利用流式细胞仪，研究人员通过计算绿色细胞个数而记录DSB量，还进行了多次对照实验，消除其它会引起细胞变绿的可能因素。比如，当研究人员消除辅助激活修复机制的基因后，没有细胞变绿，进一步证实荧光是由DNA修复机制单独激发的。Doherty说如果没有这些对照，你会对验证实验的可靠性不知所措。

  之前估计DSB数量利用粗糙、间接工具，通过计算培养基中死细胞数或者分解细胞然后跑电泳而记录断裂率。西南大学医学院Errol Friedberg（未参与实验）说：“这是一项有趣的研究，主要来自于技术观点。他们设计了一种温和的化验，即便只是在E.coli中进行的，但对真核系统应该有‘推断能力’。”

  研究人员下一步打算在高等细胞中验证这种方法。真核细胞中控制损伤修复的基因数量更多，但插入绿色荧光蛋白的基本方法应该有效。Doherty认为，DNA发生断裂的频率比想象的要低，真核细胞可能消耗巨额能量维持DNA的完整性。真核细胞很有可能进化出更为复杂的组蛋白机制。组蛋白需要紧密陪伴DNA，防止DNA断裂。

原始出处：

Letter abstract

Nature Genetics 39, 797 - 802 (2007)
Published online: 27 May 2007 | doi:10.1038/ng2051


Spontaneous DNA breakage in single living Escherichia coli cells
Jeanine M Pennington1 & Susan M Rosenberg1,2

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Spontaneous DNA breakage is predicted to be a frequent, inevitable consequence of DNA replication and is thought to underlie much of the genomic change that fuels cancer and evolution1, 2, 3. Despite its importance, there has been little direct measurement of the amounts, types, sources and fates of spontaneous DNA lesions in living cells. We present a direct, sensitive flow cytometric assay in single living Escherichia coli cells for DNA lesions capable of inducing the SOS DNA damage response, and we report its use in quantification of spontaneous DNA double-strand breaks (DSBs). We report efficient detection of single chromosomal DSBs and rates of spontaneous breakage 20- to 100-fold lower than predicted. In addition, we implicate DNA replication in the origin of spontaneous DSBs with the finding of fewer spontaneous DSBs in a mutant with altered DNA polymerase III. The data imply that spontaneous DSBs induce genomic changes and instability 20–100 times more potently than previously appreciated. Finally, FACS demonstrated two main cell fates after spontaneous DNA damage: viability with or without resumption of proliferation.

Interdepartmental Program in Cell and Molecular Biology and Department of Molecular and Human Genetics, Houston, Texas 77030-3411, USA.
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Department of Molecular Virology and Microbiology and Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Houston, Texas 77030-3411, USA.
Correspondence to: Susan M Rosenberg1,2 e-mail: smr@bcm.tmc.edu