DNA分子标记在三系杂交水稻育种、品种鉴定、遗传性分析上的应用

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DNA分标记是近年来发展起来的一种分子生物学新技术。
    在经典遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记，其类型主要包括形态标记、细胞学标记和同工酶标记。这些遗传标记在遗传学的建立与发展过程中起了重要作用，但这三种标记的数量较少，且都是以表现型为基础的，是对基因的间接反应。因而它们在现代遗传学的研究和应用中表现出极大的局限性。
    随着分子生物学技术的发展，人们建立了各种DNA分子标记技术，从而使遗传标记的范围大为拓宽。

在现代遗传学中，遗传标记是指基因组中任何座位上的相对差异。本讲座对DNA分子标记技术的优点、主要类型及其在植物遗传育种上的应用作一概述。
DNA分子标记是指在DNA分子水平上，通过一定方式或特殊手段来反映生物个体之间或种群之间具有差异性状的DNA片段。  
DNA分子标记是建立在DNA序列多态性基础之上的，它是基因的直接反应。与经典的遗传标记相比，DNA分标记具有无与伦比的优越性：  
1. 极大的丰富性  
2.多态性高，变异类型丰富。  
3. 大多数DNA标记是共显性的  
4. DNA标记对性状的表达没有影响  
5. DNA标记具有很高的稳定性
DNA分子标记的主要类型

在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：

一类是以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP），这类分子标记被称为第一代分子标记。
一类是以PCR技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标记被称为第二代分子标记；

    单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记 。它也是以以PCR技术为基础的分子标记技术。

主要的ＤＮＡ分子标记

RFLP标记:
    RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。
RFLP技术主要包括以下基本步骤：
DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。
RFLP遍布整个基因组，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。

STS标记：
STS是由特定引物序列所界定的一类标记。
　　在生物的基因组中常存在大量的单拷贝序列，根据单拷贝DNA两端的序列设计特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，所产生的一段序列在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点，将RFLP片段两端测序，设计一对专一引物即可获得STS标记。　　STS标记的检测包括PCR扩增和电泳两个步骤，实验操作非常简单；但将RFLP标记转移成STS标记以后，多态性会降低，因此需要再用限制性内切酶酶切扩增产物，产生扩增产物的RFLP，从而提高STS的多态性检测能力。

RAPD标记：
RAPD标记的基本原理是利用合成的随机引物（一般为8~10个碱基）对基困组DNA进行PCR扩增 ，然后电泳检测PCR产物的多态性。  
　　RAPD扩增所需的模板DNA量少，实验操作简单；合成一套引物可用于不同实验室，不同物种的检测。  
RAPD标记是一种显性标记，不能区分杂合与纯合基因型 ；RAPD检测受反应条件影响大，并且结果不稳定，重复因型；RAPD检测受反应条件影响大，并且结果不稳定，重复性较差。
AFLP标记：  
AFLP是RFLP与PCR两项技术相结合的产物，AFLP是RFLP与PCR两项技术相结合的产物，RFLP技术的主要步骤：DNA提取→有两种限制性内切酶酶切DNA→寡聚核苷酸接头的连接→对限制性酶切片段的选择性扩增　　扩增产物的电泳分析。  
由于不同材料DNA酶切片段存在差异，因而便产生发扩增产物的多态性。  
　AFLP标记技术具有多态性高、提供的信息量大、稳定性好等优点，但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。

SSR标记：
SSR标记又叫微卫星DNA标记，它是指基因组中存在的由2-5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。
由于串联重复序列重复次数的不同就产生发等位基因之间的多态性，由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物可以进行PCR扩增。
SSP标记具有共显性、高多态性和易于检测等优点，是一种理想的分子标记，早期设计SSR引物需要筛选大量的DNA克隆，发展微了星标记较为困难。

SNP标记：  
　SNP标记也是以PCR技术为基础的分子标记技术它是指不同生物个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特异PCR引物扩增和电泳检测显示出来。  
SNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，因而它的数量非常丰富。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。  
　目前SNP作为一种的分子标记技术，已有2000多个SNP标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植 物上也发展了一些SNP标记。

DNA分子标记在植物生物技术中的应用
DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：
构建高密度的遗传连锁图 ：在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。
进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。

遗传多样性和物种亲缘关系：分子图谱的构建和基因定位更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。
DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。  
种质鉴定和遗传背景分析：利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺形状基因，分离和鉴别遗传材料，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结构畸变的检测。  
育种中的分子标记辅助选择：长期以来，植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。
现代DNA分子标记具有广阔的应用前景，虽有不足，但与形态标记、同工酶标记、染色体标记相比有许多优点，因此，DNA分子标记具有更高的可靠性和高效性，更容易从分子水平上研究物种亲缘关系、种子资源保存等。 DNA分子标记也为生物多样性研究提供可靠有力的证据。但是由于物种多样性、遗传多样性、环境多样性的影响，对于不同的生物体不可能采取一套统一的方法进行研究，应具体问题具体分析。

PCR技术在植物分子生物学中的应用  
PCR—聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是项体外特异复制特定DNA片段的核酸合成技术，这项技术是分子生物学研究领域的一次创举。该技术自Kary Mullis（1984）发明以来，已出现了多种改型和改进。
    进行PCR时，通常需要合成两个待扩增片段两侧的寡聚核苷酸引物，这些引物分别与待扩增片段的两条链互补定向，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增。