供体-受体原生质体融合与胞质杂种的形成

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原理：
体细胞杂种有核杂种（nuclear hybrid）和胞质杂种（cybrid）之分。前者指双亲完整原生质体的融合产物，后者是指一亲本的去核原生质体，（即胞质体cytoplast）与另一亲本完整原生质体融合的产物，胞质杂种一般只具有一个亲本的细胞核，而具有两个亲本细胞质的遗传物质，胞质杂交可用来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄性不育特征，抗除草剂特性，对某些抗生素的抗性，以及一些与光合作用有关的特性，通过产生胞质杂种来转移这些特性具有明显的优点，因而在遗传育种中具有特殊重要意义，供体受体原生质体融合（donor-recipient protoplast fusion）系统是产生胞质杂种的有效方法。经过不断的改良，现已普遍采用双失活程序（Menczel,1984）。即将一个亲本的原生质体经辐射处理使细胞核失活，来作为细胞质供体，另一亲本（受体）用代谢抑制物碘乙酸盐类处理，使细胞质暂失活。由于生理互补效应，杂种细胞可以生长和持续分裂。因而在双失活处理的供体-受体原生质体融合系统中，不需要双新具有选择标志，杂种即可被筛选出来。

材料、仪器与药品
1．材料
任何两种植物的分离原生质体。本实验可选用叶肉细胞原生质体作胞质供体，而用培养细胞原生质体为受体。
2．器材
用于分离、收集和原生质体融合实验的全套设备。参看本实验I。能提供人所需剂量的钻（60Co）源。
控温水浴锅
3．试剂
分离原生质体用的全部试剂。
PEG法用于原生质体融合的全部试剂（参考本实验I）
W5溶液：
CaCl2·H2O   125mmol/L
NaCl         155mmol/L
KCL         5mmol/L
葡萄糖       5mmol/L
碘乙酸（2-iodoacetic acid）或碘乙酰胺（iodoacetamide）溶液：配在W5溶液中，其参考浓度为10mmol/L。


方法
1． 原生质体的分离和收集，参看植物原生质体的分离和培养实验。
2． 将作为胞质供体的原生质体（叶肉组织原生质体）悬浮在W5溶液中，量于离心管中，密度调整至105/ml。
3． 60Co-r射线辐射使核失活：将盛原生质体的离心管放在600C源设备中，达到给定剂量的时间后取出。
辐射剂量的选择可通过实验来确定。一般在1~10krad之间，但对这些植物来说所有剂量可高到100~300krad.
4． 碘乙酸盐（IOA）处理受体原理质体：将受体原生质体悬浮在适当浓度IOA溶液中，其密度调整为10 5/ml左右。IOA溶液在1~30mmol/L之间，处理20~30min后，用W5溶液离心洗涤二次，并悬浮在W5中，使密度调整为105/ml。
5． 用PEG方法融合
6． 培养融合处理后的原生质体。

结果
1． 核失活处理结果的观察：辐射处理后，将原生质体进行培养，并镜检受伤害迹象。若能有半数左右的原生质体不能继续存活，则所有剂量可算核致死剂量。
2． IOA处理结果的观察；IOA作为代谢抑制物，可引起线粒体生理失活，但对核物质不影响。处理之后的原生质体培养不能持续分裂，但可以存活数日，甚至有少数几次分裂。
3． 胞质杂种细胞的观察：需和经处理的二亲本原生质体和正常亲本原生质体培养作比较。经数日培养后，观察胞质杂种细胞发展。