线粒体ＤＮＡ的异质性与检测方法

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线粒体ＤＮＡ的异质性与检测方法
刘　艳　胡　婧　黄　原
共2页 [1][2]

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　　摘要：线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医、生物技术等领域有重要的应用。本文从自然发生(包括体细胞突变、父系渗入和杂交)和人工产生(包括转基因、细胞融合、核移植和转线粒体)两大方面系统地介绍了线粒体DNA异质性的产生机制及其遗传。并介绍了线粒体DNA异质性的检测方法，已知突变位点mtDNA异质性的检测方法有原位PCR技术、PCR-RFLP和实时荧光定量PCR技术，未知突变位点mtDNA异质性的检测方法有长PCR技术、时相温度梯度凝胶电泳(TIGE)和变性高效液相色谱(DHPLC)等。最后对克隆生物中线粒体异质性检测的应用实例作了介绍。
　　关键词：mtDNA；异质性，父系渗入，细胞融合，核移植；转线粒体，检测
　　中图分类号：Q953文献标识码：A文章编号：0250-3263(2006)05．120-07
　　
　　1　线粒体DNA的异质性
　　
　　一个生物体中一般仅有一个类型的线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。当不止一种类型的mtDNA在单个个体中存在时称mtDNA的异质性(heteroplasmy)，也就是说，同一个体同时存在两种或两种以上类型的mtDNA。并且异质性发生的频率和多态性水平在不同组织和个体中是不同的，在肌肉组织和衰老个体中发生频率较高。
　　异质性可分成长度异质性和位点异质性两类。长度异质性(length heteroplasmy)的大多数情形是线粒体基因组的某一段，主要是D环区的串联重复。现存的长度异质性多被认为是中性选择的结果。位点异质性(siteheteroplasmy)表现在一个或多个核苷酸位点上不同的mtDNA，即主要是由于DNA上某个或数个碱基的转换、颠换、插入或缺失等点突变所产生的，引起个体内的mtDNA异质性。异质性点突变的速率是随年龄而增长的，如C-stretch区发生异质性突变的速率就反映此规律。位点异质性极少数是具有病理性的，大多都为中性突变。异质性的细胞在连续分裂过程中会发生遗传漂变，这使得细胞中突变型mtDNA的比例从0％～100％之间变化。
　　线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医和生物技术等领域有重要的应用。本文系统地介绍线粒体DNA异质性的产生机制、遗传规律、检测方法及在克隆生物中的应用实例。
　　
　　2 自然发生的线粒体DNA的异质性及遗传
　　
　　2．1体细胞突变形成的异质性 个体在生长发育过程中，体细胞中的mtDNA会发生突变，由此引起个体不同组织或细胞的线粒体具有异质性。mtDNA缺乏组蛋白保护，与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，较易受自由基攻击，氧化损伤从而引起突变；复制快速且无校读功能以及缺乏有效的DNA修复机制，因而具有较高的复制错误率及较低的修复能力，所以其突变率是核DNA的10～20倍，其相应的进化速度比核DNA快5～10倍。因此，随着时间的推移，同一个体发生部分突变的mtDNA不断复制，进而形成了具有异质性的细胞亚群。
　　体细胞突变可发生在个体的不同时期，并且这种突变能引起个体病变。通常是随着个体年龄的增加，它们的突变数目也随之增加，当mtDNA突变数目达到某一阈值(threshold level)，大多为60％或更高，便可引起某组织或器官功能的病变，即阈值效应(threshold effect)。这个阈值的变化范围是依赖于突变类型、组织类型和需氧条件等因素，但最主要的影响因素是年龄，且这种阈值随年龄的变化而影响显著，年龄越大的个体，其阈值越低。
　　20世纪90年代早期，在多种动物(秀丽线虫Caenorhabditis elegans、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、小鼠Muc muculas、恒河猴Macacamulatta、黑猩猩Pan troglodytes和人类HomoSapiens)中发现，线粒体基因组的重组现象也与衰老密切相关。年龄相关的mtDNA突变主要发生在后有丝分裂的组织中，大多情况下，这些突变都是异质性的(突变和野生型mtDNA共存)，并且小比例的野生型基因具有强的保护效应来对抗线粒体的代谢缺陷症。
　　线粒体DNA也普遍存在多缺失(multxpledeletions)现象，研究表明这种mtDNA的多缺失是与各种病变情况相关，特别是肌病(myopathy)、多肌肉痛、风湿性关节炎、心肌症以及自然衰老的疾病有关。
　　2．2父系渗入产生的异质性 通常人们认为，动物的mtDNA是严格母性遗传的，但已有研究发现，在果蝇、鼠、扇贝和人类中，线粒体有双亲传递现象，父本的线粒体能渗入至下一代。据现今对mtDNA的认识，mtDNA父系遗传可能存在有两种机制，一是父系mtDNA的渗入机制，通过对小鼠精子线粒体示踪标记的研究表明，随着受精卵的发育，精子线粒体在受精卵中所占的比率逐渐下降甚至完全消失。这说明mtDNA父系遗传涉及到受精过程中父系mtDNA在受精卵中的存留，同时在动物受精过程中肯定存在某种机制来限制外源DNA在胞质中的扩散。另一种可能的机制是mtDNA的重组。有实验报道mtDNA之间存在重组，Awadalla等人通过对灵长类mtDNA的连锁不平衡分析研究发现，mtDNA同样广泛存在重组现象，而且重组的最大可能就是父母mtDNA之间的重组。
　　2．3杂交形成的异质性 mtDNA的异质性在近缘种间杂交个体中是一个较为普遍的现象。mtDNA主要由卵子传递，各杂交动物mtDNA大多都表现为母系遗传。mtDNA严格的母系遗传方式有助于依据mtDNA的差异追溯不同的母系起源，同时也可预测杂交的方向。但近期研究检测表明，杂交后代中也具有极微量的父系mtDNA。通过对小鼠种内杂交的实验显示，杂交样本中父系mtDNA在胚胎发育的前核后期被降解，牛和恒河猴在八细胞期之前降解。这说明杂交形成的异质性是由于细胞内识别异源mtDNA的特异性降低，导致依赖于泛素识别异源物质的降解机制或者类似于泛素机制的缺乏，从而允许精子mtDNA在杂交后代中的遗传(尽管以很低水平)，同时也说明了线粒体遗传中“瓶颈效应”的作用。
　　
　　3　人工产生的线粒体DNA的异质性及遗传
　　
　　3．1 转基因生物中的异质性 截止目前，人们对转基因生物中的mtDNA异质性研究很少，相关的报道大多集中在核移植和胞质移植方面。有人对转基因鱼进行了研究，发现往往在胚胎发育的晚期发生异源基因的整合，经过注射的DNA在整合之前的细胞中均能检测到，也就是说囊胚期能检测到异源线粒体，出生后的个体不一定能检测到。
　　3．2 细胞融合形成的异质性 细胞融合(cellular fusion)使供体和受体两种mtDNA存在于融合的细胞质中，并且供体来源的线粒体在胚胎发育过程中占主导地位。对包含有不同突变mtDNA数量的胞质杂合体研究显示，绝大多数DNA突变的线粒体仍能具有其正常功能，其遗传表现是隐性的。也就是说，细胞在发生呼吸链缺损之前能够容忍具有高百分比(70％～90％)的突变mtDNA。通过对野生型和突变型两种mtDNA共存的转基因小鼠模型分析表明，生命体中存在着“线粒体问的互补效应机制(Inter-mitochondrial complementation mecha-nism)，使细胞融合的杂合体具有修复缺损呼吸链的作用。融合产生的mtDNA异质性的遗传方式通常是以非随机的遗传漂变机制进行的。

　　3．4转线粒体细胞中的异质性 转线粒体(mitochondrial transfer)最早可追溯到1989年，Ebert等将异源线粒体注入小鼠胚胎，经过注射的胚胎移植后发育正常，但在出生的仔鼠中检测不到异源线粒体。通常显微注射线粒体产生的转线粒体小鼠都具有异质性细胞(突变和野生线粒体基因组共存)。现在发展起来的转线粒体细胞是应用细胞融合和显微注射等分子细胞生物学技术，以无线粒体DNA细胞即 为中介，将细胞中全部线粒体DNA被外源的线粒体DNA所替换，而其核基因仍保持不变的细胞系。研究表明，转线粒体细胞中的临界线粒体数目大约是100 000个，这样才能提供足够的能量来保证胚胎发育、细胞分裂及细胞的动态变化等过程，即最低ATP含量阈值(minimumthreshold of ATP content)。同时实验结果表明，这种细胞中不只存在一种线粒体基因型，并且其中一种基因型常发生选择性遗传漂变和扩增，这是由真核有机体中存在消除外源mtDNA的机制所决定的。该技术在研究核与线粒体基因组的相互作用以及线粒体DNA突变的分子致病机制等方面发挥重要作用，在一些线粒体相关疾病的研究中得到广泛应用。
　　
　　4　线粒体DNA异质性的检测
　　
　　4．1对已知突变位点mtDNA异质性的检测
　　4．1．1原位PCR技术原位PCR技术(in situPCR，ISPCR)是随原位杂交技术检测扩增产物而发展起来的，是在细胞水平上研究mtDNA突变的分布及定位的一种比较理想的方法，它使PCR反应可直接作用在组织切片、细胞涂片上，并能对原细胞位点上的DNA直接进行扩增。这种方法能更好的分析重组或突变mtDNA在细胞及其各种组织中的分布，为解析异质性的分布提供可靠的技术支持。同时，结合酶组织化学方法能使mtDNA突变和其单个细胞的生物能缺陷(bloenetgy defects)之间的关系相联系起来。这个方法比原位杂交更灵敏，仅用低PCR循环数目就能检测到4977 bp长的mtDNA缺失，但此方法不能测到更长片段的缺失。
　　4．1．2 PCR—RFLP PCR—RFLP是针对已知点突变mtDNA的检测。此法首先是对含有突变位点片段的mtDNA和野生型mtDNA分别PCR扩增，接着再以扩增好的产物为模版，采用相应的限制性内切酶分别对突变和野生的DNA片段进行酶切，消化产物电泳并比较分析野生与突变的酶切图谱。常见用于分析人类线粒体DNA突变点为A3243G，引物3116～3134F和3 353～3 333R扩增238 bp长的含A3243G的DNA片段，变性94℃45 s，复性55℃45 s，延伸72％45 s，30个循环；扩增产物再用HaeⅢ酶切消化37℃、2 h，产物直接电泳检测即可。
　　4．1．3实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR)自1996年由美国应用生物系统公司推出后，很快就应用到对线粒体异质性的检测。通过该技术可以对发育至不同阶段的克隆动物mtDNA的变化趋势进行实时监控，并可定性及定量检测突变型mtDNA。此法是基于已知突变位点的检测，涉及一特定PCR引物的合成，此引物序列在3'末端含有两个错配碱基(野生或突变碱基)，从而特定扩增野生或突变DNA序列，即用特定等位基因引物来定量确定异质性突变的比率。此法可快速定量检测异质性mtDNA，比PCR—RFLP检测低频率突变体更为精确。Langpxng He等人用此方法与Southern blotting和三引物竞争PCR等技术进行了比较检验分析，发现用此技术检测mtDNA异质性的灵敏度高，达到了单个细胞、单个碱基的水平，成功地检测到单个COX缺陷型细胞mtDNA的单缺失和多缺失，以及缺失的相对含量等。
　　4．2对未知突变位点mtDNA异质性的检测
　　4．2．1长PCR技术长PCR技术(Long PCR)是分析多种mtDNA基因重排的好工具，这是由于它能独立分析远大于4 977个碱基长度的缺失。这个技术也广泛应用于全线粒体基因组的扩增。一般的PCR技术只能用于检测到<5 kb大小的目标片段，并不能充分解释所观察到的多mtDNA基因重组现象。长PCR不仅能检测到一般的缺失，而且能检测到其他主要类型的缺失和发生在线粒体基因组的多重组现象。
　　4．2．2 时相温度梯度凝胶电泳TYGE TTGE是一种新型的检测DNA片段中单个碱基突变的电泳方法。它是基于突变的单碱基对在变性凝胶电泳中的熔解特性从而分离异源双链(heteioduplex)与同源双链(homoduplex)，即突变型与野生型DNA片段。变性聚丙酰胺凝胶电泳的同时增加温度梯度，使野生型与突变型DNA随温度的增加而逐步解链变性。由于变性温度因DNA序列不同而异，当有单碱基发生突变时其解链的变性温度也不一样，从而在达
　　 酸序列组成不同设计各自特异性引物，运用PCR技术扩增特异片段，其各自扩增片段的长度大小不一(人扩增的产物大小为500 bp左右，而猪的扩增产物为300 bp左右)，电泳分离不同分子大小的扩增产物，为快速、简易、灵敏地鉴别异源mtDNA提供方法以及为检测异源mtDNA提供思路(未发表资料)。根据人mtDNAcyt 6的同源序列设计本实验的引物：正向引物HR：5’CAC CAG TCT TGT AAA CC 3’，反向引物HF：5’TGA AGT AGG AAC CAG AT 3’。人的特异性引物扩增出的片段应在500 bp左右。运用ClusalX软件把从GenBank中获得的10条猪线粒体cytb的基因与人的全线粒体基因组进行序列比对，分析序列同源性和序列的相似度。以相似度较低或同源性较差的一段序列作为设计引物的范围，设计出最佳引物。SR：5’TAT AGGAATC CGT AGT ATA 3’：SF：5’ACATCC GAA AAT CAC AC 3’，扩增产物的长度为315 bp。2个PCR反应在相同条件下进行，扩增条件：预变性94℃2 man，变性94％40 s，复性43℃=1 min，延伸72℃1 min，32个循环。PCR反应结束后直接通过凝胶电泳即可分析异源mtDNA的存在，为快速简便的鉴定异种移植细胞mtDNA的类型提供方法。