发色底物测定大曲中α一葡萄糖苷酶活力

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一、目的
通过用发色底物测定α-葡萄糖苷酶活力实验，了解并掌握外切糖苷酶活力测定方法，使对酶活力的概念有更深入的理解。

二、原理
酶活力是酶蛋白质催化能力的一种定量表示，其活力单位目前大多都采用国际标准单位，亦即每分钟催化形成一微摩尔产物或消耗一微摩尔底物所需的酶量为一个国际标准单位，通常用”U”表示。蛋白酶与无机催化剂不同，它的催化活力不仅与其自身有关，而且受反应环境的影响，例如，产物抑制作用、反应过程中的酶失活以及抑制因子的生成等，所以酶活力必须用初速度表示。但实际测定时考虑到产物浓度在一定时间内与反应时间呈线性关系，一般就用产物在这段时间内的变化量计算酶活力。
淀粉酶是糖苷水解酶中的一类，它的活力一般都用测定还原糖的办法进行分析。但由于淀粉酶的四种组分(淀粉-1，4-糊精酶、淀粉-l，4-麦芽糖酶、淀粉-1，6-糊精酶和α-葡萄糖苷酶)的水解产物都是还原糖，因此用还原糖法无法准确测定单一酶活力。而发色底物法则可以克服这种困难，因为它是在糖苷配基上联上一个发色基团。比如，α-葡萄糖苷酶活力测定是采用对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷键后可以释放出对—硝基苯酚(pNP)，在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度增加值计算酶活力。

三、仪器和试剂
实验原料：
大曲浸提液
仪器
分光光度计、恒温水浴锅、移液管(2mL)、试管、吸耳球等。
试剂
1. 对—硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)：1.25mM pNPG(75.2mg pNPG溶于200mL 50mM
醋酸缓冲溶液(pH5.6))。
2. 对一硝基苯酚(pNP)：4m mol/LpNP(111.3mg溶于200mL 50mM醋酸缓冲溶液(pH5.6))。
3. 50mM醋酸缓冲溶液(pH5.6)：16.4克NaAC加 12mL HAc并定容至 1000mL。
4. 1M碳酸钠

四、操作步骤
(一)制作对—硝基苯酚(pNP)标准曲线
按下表分别取不同体积的对—硝基苯酚(4mM)，用50mM醋酸缓冲溶液(pH5.6)稀释成一系列浓度。然后在分光光度计上测定λ=410nm处的光密度，以浓度为横坐标，光密度为纵坐标作曲线。

(二)α-葡萄糖苷酶活力测定
取 0.8mL对—硝基苯酚α-D-葡萄糖苷(pNPG)(1.25mM)，加入 0.2mL大曲浸提液，迅速混匀后于40℃水浴中保温10分钟，取出并立即加入2mL 1 M的碳酸钠溶液终止反应，用分光光度计测定λ=410nm处的光密度，在标准曲线上查出相当于对—硝基苯酚的量，并计算酶活力。酶活力单位定义为：在上述分析条件下每分钟催化形成一个微摩尔pNP所需要的酶量为一个活力单位。
五、计算

V—酶液量mL；
n:—酶液稀释倍数；
t—反应时间(min)