红细胞膜的制备及其成份分析(磷脂、胆固醇)

yujian623

随着生物膜研究的迅速发展，在膜的结构及功能的研究中分离和鉴定生物膜常常是必要的。为进行膜结构的生物化学分析，必须首先分离出纯净的细胞膜。
哺乳动物的红细胞膜在分离状态下。一般称为”血影”，其没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器，经过制备，容易得到纯粹的细胞膜，并且在取材方面来源方便，因此哺乳动物的红细胞膜是研究细胞膜的好材料。
从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜，第一步，将血液取放在加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离出红细胞，然后用等渗缓冲液重复洗涤多次，去除血浆。第二步，将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中，由于渗透压力作用于细胞质膜，使红细胞膨胀而溶血。最后一步，将溶血的红细胞经过充分反复洗涤．高速离心，去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。
(二)仪器、试验材料和试剂
仪器
冷冻离心机、冰箱、自动移液管、相差显微镜、冷冻干燥机等。
原料
哺乳动物的血液
试剂
1. pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(含有0.15mol/L 氯化钠的5mL，pH7.4磷酸盐缓冲液)：
贮液A：称取0.7808磷酸二氢钠溶于水，定容至1000mL；
贮液B：称取3.5828磷酸氢二钠溶于水，定容至2000mL；
取380mL 贮液A 加1620mL 贮液B，用少量浓盐酸调PH 至7.4．再称取17.5g 氯化钠加入其中。
2. pH7.4低渗tris 缓冲液(10mmol/LpH 7.4Tris-盐酸缓冲液)：
贮液A：称取2.42gTis，溶于水，稀释至500mL；
贮液B：取0.84mL36％一38％盐酸，稀释至100mL；
取500mL 贮液A 加414mL 贮液B，用水稀释至近于2000mL，用6mol/L 盐酸调pH7.4，再定容到2000mL。
3. 肝素－PH7.4等渗磷酸盐缓冲液：
将肝素溶于PH7.4低渗Tris 缓冲液中，使每毫升含肝素500单位。
(三)操作步骤
1.血液的收集及洗涤
将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每30mL 血液加约5mL 肝素－pH7.4等渗磷酸盐缓冲溶液。
为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在－4℃低温下进行。取30mL血液，于冷冻离心机(4℃)中3000r/min 离心20min，使红细胞沉淀，用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层，以避免其他类型细胞的混入。
将红细胞置于3倍量预冷的pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，4℃5000r/min离心15min，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。
2.溶血和红细胞膜的洗涤
在洗净的红细胞中，按照1:40的比例加入预冷的10mmol/LpH7.4低渗Tris(三羟甲基氨基甲烷)－HCl 缓冲液，边加边缓慢搅拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min 离心15min，使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3～5次，最后获得白色的红细胞膜样品。
注意：①溶血时低渗缓冲液的用量越大，红细胞膜中血红蛋白的残留量越少，但体积大，离心费时间。因此，红细胞与缓冲液的容量比例，以1:40为宜。②膜的重量很轻，在溶血后离心倾倒上清液时容易流走，因此要特别小心，尽可能防止膜的损失。③在制备过程中，若pH 值降低，残留的血红蛋白会迅速增加。当pH 保持在7.4时，红细胞膜中的血红蛋白含量仅占总蛋白量的3~5％，相当于血液中总血红蛋白的0.1％。但pH 值降低至7.0时，血红蛋白增加至20％。④上述方法适用于大白鼠和人红细胞膜的分离。牛、猪等红细胞膜的制备，若反复进行低渗处理，将造成膜外表面包含具有乙酰胆碱酯酶活性的酯蛋白脱落，使膜容易破碎，得不到较完整的膜样品。若在低渗缓冲液中加入1mmoL氯化钙，即可完全防止这种膜的不稳定性。
将最后一次离心所得到的红细胞膜悬浮在2～4mLpH7.4等渗磷酸盐缓冲液中。记录悬浮液的总体积。注意，有时在膜的下面有少许未解体的红细胞残留物，不要将这部分残留物悬浮在缓冲液中。
3.细胞膜的镜检
取少量膜样品悬液，在相差显微镜下进行观察，确定膜制品是否纯净。在视野中纯净的膜为扁圆形，白色，膜表面赂有皱纹。在视野中应不含有完整的红细胞或污染的细菌。
4.膜的冷冻干燥
样品放在一个称好重量的(在分析天平上准确称量)小称量瓶中，冷冻干燥至样品全干(冰冻干燥可以过夜，冷冻干燥的样品更易溶于SDS 溶液中)，称量带有冷冻干燥制品的小称量瓶，记录膜的产量。
将冷冻干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以备膜结构成分的分析。

二、膜磷脂的分析(薄层层析法)
(一)原理
膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇。本实验用甲醇—氯仿可将膜中的脂类组分提取出来，同时破坏疏水作用、使膜蛋白变性，再采用薄层层析法进行磷脂的定性分析及定量测定。
(二)仪器和试剂
仪器
具塞试管、普通离心机、15cm×15cm 玻璃板、薄层层析展层缸、定磷用的全套器材。
试剂
1. 硅胶H—碱式碳酸镁混合物：称取97g 硅胶H，3g 碱式碳酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。
硅胶H—碱性硅酸镁混合物：称取98g 硅胶H，2g 碱性硅酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。
2. 磷脂标准样品混合液：称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂和卵磷脂等各5mg，溶于l0mL 氯仿：甲醇(1:1，V/V)中。
3. 氯仿
4. 甲醇
5. 乙酸
6. 氨水
7. 碘
8. 高氯酸
9. 定磷试剂
(三)操作步骤
1.膜脂的提取
将冰凉干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8mL 等渗的磷酸盐缓冲液中(膜不会完全溶解)，加3mL 氯仿：甲醇(1:2，v/v)，盖上试管塞，剧烈振荡最少1min，另外再加1mL 氯仿振荡1min，最后加1mL 水振荡1min。用台式离心机低速离心5min，在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液(膜脂类在下相液中)，转移到一个小烧杯内，置真空干燥器内蒸发至干。
2.磷脂的分析
(1)硅胶板的规格及制作方法
准备几块15cm×15cm 的玻璃板，洗净，烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。
取3g 硅胶H—碱式碳酸镁混合物或硅胶H—碱性硅酸镁混合物，置小研钵中。加14mL0.5％pH7.0羧甲基纤维素溶液，研磨数分钟，将研磨好的浆液倒在一块备好的玻璃板上。用玻棒将其铺开，然后轻轻颠动玻璃板，使浆液均匀分布。置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化30min，贮于真空干燥器内用。
(2)点样
用200mL 氯仿—甲醇(1:1，v/v)溶解2mg 干燥的脂类。取100μL 溶解的样品溶液，点在薄层板的一个角上距板的边缘约2mm 处，点样的面积直径不超过5mm，点样一次待样品干燥后再点，重复数次。
另取一块薄层板，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液(内含每种标准磷脂各20~50μg).
(3)展层
采用倾斜上行法展层。展层缸内用新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析(即在第一相展层后，将薄层板取出，调转90度。，再进第二相展层)。
第一相溶剂系统：氯仿：甲醉；氨水(25％)：水＝90 : 54 : 5.5 : 5.5(体积比)；
第二相溶剂系统 : 氯仿 : 甲酵 : 乙酸 : 水＝9 : 40 : 12 : 2(体积比)；
每相层析约需2h，当溶剂前沿距板的顶端2~3cm 时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置。第一相展层后，取出，在空气中干燥约15min，若空气湿度太大时，则须在放有浓硫酸的干燥器内干燥半小时。
玻璃板(20cm×20cm)涂上硅胶H.R 含有2w1%硫酸镁。 脂类的混合物点在右底角(距边缘3cm 处)。展层，第一相溶剂系统氯仿：
甲醇：氨水(25%)：水(90：54：5.5：5.5，体积比)，第二相溶剂系统氯仿：甲醇：乙酸：水(90：40：12：2，体积比)。缩写CHOL=胆固醇，FF!![/url]<font color=#ff0000>谢绝广告帖！再发封ID！</font>游离脂肪酸，CL=心磷脂，P!![/url]<font color=#ff0000>谢绝广告帖！再发封ID！</font>磷脂酸，PE=磷脂酰乙醇胺，PI=磷脂酰肌醇，PS=磷脂酰丝氨酸，PC=卵磷脂，SPH=鞘磷脂，LPE=溶血磷脂酰乙醇胺，LPC=溶血卵磷脂，LPS=谱溶血磷脂酰丝氨酸，DPI=磷脂酰二磷酸肌醇。
4)显色及定位
将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘遇磷脂后，发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕黄色。
斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf 值，鉴别红细胞膜中含有磷脂种类。
将磷脂的斑点分别从薄层板上刮下来．转移到试管中，每个样品加1mL70％高氯酸，在190℃消化，然后测定磷含量(定磷方法)。在测光吸收之前，应离心除去硅胶。经测定后，从定磷的标准曲线计算出每个磷脂斑点中磷含量，可推算出每种磷脂在膜中含量。
三、膜胆固醇的测定
(一)原理
胆固醇(胆甾醇)与铁矾显色剂相互作用可生成紫色的胆固醇—铁复合物，其颜色的生成在一定范围内符合Beer 定律，在波长560nm 处有最大光吸收。反应过程中，浓硫酸与冰乙酸相混合时产生的热可为颜色的生成提供合适的条件。
本实验中所选用的试剂也可用于测定血清总胆固醇的含量。其中乙酸铁—乙酸铀试剂不仅起蛋白质沉淀剂的作用，同时又可以克服色原(主要是脂类和胆红素)的干扰。
(二)仪器和试剂
仪器
721型分光光度计、台式离心机。
试剂
1.胆固醇标准溶液：精确称取200mg 胆固醇，溶于冰乙酸中，稀释到100mL，使浓度为2mg/mL。
2.铁矾显色剂
(1)储备液：溶解4.463g 硫酸铵铁(FeNH4SO4· 12H2O)到100mL85％磷酸液内，贮存于干燥器内，
此溶液在室温下很稳定。
(2)常备液：吸取10mL 储备液，用98％的浓硫酸稀释到100mL，贮于干燥器内，以防吸水。此溶液至少可稳定2个月。
3.乙酸铁—乙酸铀试剂
称取0.5g 三氯化铁(FeCl2·6H2O)，置小烧杯中，加入3mL 浓氨水，搅拌均匀，产生红棕色氢氢化铁沉淀，过滤。用蒸馏水洗至无氨味，取下沉淀，溶于冰乙酸中。再加入0.1g 乙酸铀[UO2(C2H3O2)2]，用冰乙酸稀释到100mL，振摇后避光放置过夜，次日再振摇，贮于棕色瓶内。
(三)操作步骤
1.胆固醇标准曲线的制定吸取2mg/mL 胆固醇常备液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL(相当于胆固醇的量为0、40、80、120、160、200μg)分别置于干燥的试管内，再分别加入0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0.00mL 冰乙酸．使每管中液体总体积达到0.10mL。每管内加入5mL 乙酸铁铀试剂，摇匀。然后从每管各吸取3mL 混合
液，分别移入另一套干燥试管中，沿管壁加入2mL 铁矾常备显色液．用手指弹动管的底部，使其彻底混匀，在15～90min 内，于560nm 波长处测定A 值。为得到准确的数据，应将标准曲线上的各点做2~3个重复。以胆固醇的含量为横坐标，A 值为纵坐标，绘出标准曲线。
2.膜脂类胆固醇含量的测定
称取2~5mg 干燥的膜脂类(尽可能精确的称量)，用冰乙酸充分溶解，制得0.5mg/mL 溶液。取1支试管，加50μL 样品溶液，再加入50μL 冰乙酸，及5mL 乙酸铁铀试剂，充分摇匀，如有沉淀，于2500r/min 离心15min。吸取3mL 上清液，移入另—试管，沿管壁加入2mL 铁矾常备显色液，用手指弹动管的底部，使其彻底混匀，放置30min 后，于560nm 波长处测A 值。在进行样品测定时，要同时做空白对照，即以50μL 冰乙酸代替样品溶液，其余操作同上。为得到准确的数据，测定样品时，须同时做二、三支重复测定管。