植物细胞周期观察

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植物根尖分生组织的细胞，依一定的程序有规律地进行着有丝分裂过程，植物种类不同，细胞周期所需时间不同。

每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再放置在显微镜下进行观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
一些植物根尖细胞的分裂周期（小时）


根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位，根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
如果植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。实验结果显示：植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间不尽相同，洋葱根尖细胞以6点到9点分裂相较多。适于取材。
三、实验材料
大蒜、洋葱的鳞茎或蚕豆的种子
四、实验器具和药品
1．用具：载玻片，盖玻片，指管，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，吸水纸。
2．药品：无水酒精，冰醋酸，醋酸钠，改良苯酚品红。
五、实验过程
1．材料培养
先剪去洋葱的老根，然后置于盛有水的烧杯上，等不定根长出2cm时，进行预处理；或将蚕豆等种子经过吸胀处理24小时后，平展于铺有吸水纸的白磁盘中，加入适当量的水，于25℃培养，待侧根长到2cm进行预处理。
2． 预处理
预处理可以降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，使更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前把根尖放到药剂中处理3—4小时。可利用进行处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8—羟基喹啉等，也可以经过低温处理以达到同样的效果，较成功的例子主要是一些禾本科的农作物，例如：小麦、黑麦、大麦用1~4℃，水稻和玉米用6~8℃，均获得较好的效果。处理方法是将活体或切取根尖侵入自来水或蒸馏水中，放置在冰箱中合适的温度层处理20—40小时。在野外或无冰箱条件下，可在保温瓶中装一些冰块做低温处理。
处理时机：当根尖长到1.5cm～2cm左右时进行处理，此时分裂相较多，制片效果好。

另外，各种生物体细胞分裂高峰期也不尽相同，于细胞分裂高峰期取材效果为好。例如洋葱根尖细胞以上午6—9时左右为分裂高峰期，蚕豆则每日有两个分裂高峰期，分别为上午9时左右和下午2—3左右。

3．取材固定
将预处理后的根尖剪下，放入卡诺固定液，固定2～24小时。然后依次放入90％、80％和70％酒精溶液，最后保存于70％酒精溶液中放于冰箱中，但保存时间最好不超过2个月。
4． 制片：
水洗：将从保存液中取出的根尖用水冲洗掉酒精；
解离及制片：解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。
酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。
将水洗后的根尖放到0．1mol／LHCl中，在60℃水浴中解离8－10分钟，或用浓盐酸：乙醇＝1：1混合溶液处理根尖10分钟。
用蒸馏水漂洗酸解后的根尖，放在载玻片上。将根冠和伸长区以上部位切去，保留分生组织细胞，并将生长点细胞切成细碎组织，根据分生组织的的大小，一般每一根尖可制片3～4片，加上1滴改良苯酚品红染色液，染色10～15分钟。根尖着色后即可压片观察。
酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，易于进行观察。
将水中漂洗过的根尖用刀片切除根冠以及延长区(根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成2—3片)，把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶(2％)和果胶酶(0．5％)的混合液中，在28℃温箱中解离4—5小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0．1mol／L醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再换入45％醋酸。
酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用45％醋酸压片，如作核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良苯酚品红中染色，经过酶处理的组织染色速度快。
一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相。
5．观察：
选择细胞分散、分裂相较多以及染色体形态舒展的制片进行观察。
注意观察细胞有丝分裂各时期特点。
6．封片：把压好的玻片标本，放在于冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。
六、注意事项：
1．压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地；
2．解离时间不可过长，以免染色体结构受损；
3．用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，会使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。
七、附录
1．卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸(现配现用)
2．酶液的配制：
以0.1ml／L醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶(2％)和果胶酶(0．5％)的混和液。
3．酸解溶液：1N盐酸或浓盐酸和乙醇各一份混合配成。
4．染色液的配制：
4．1 配方1．石碳酸品红(Carbol . fuchsin)，先配母液A和B。
母液A：称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70％酒精中(此液可长期保存)。
母液B：取母液A10毫升，加入90毫升的5％石碳酸水溶液(2周内使用)。
石碳酸品红染色液：
取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37％的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方II，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。
4．2 配方II：改良石碳酸品红
取配方1．石碳酸品红染色液2一10毫升，加入90—98毫升45％的醋酸和1．8克山梨醇(sorbit01)。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。
八、实验流程图：
培养（根部遮光培养）
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预处理
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取材
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固定
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制片： 水洗 酸解 水洗 染色 压片
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观察（注意观察有丝分裂各时期染色体特征）