亲和免疫组织化学技术的染色步骤

yujian623

一．卵白素和生物素免疫组织化学染色
1．标记卵白素—生物素（LAB）技术
（1）石蜡切片常规脱腊入水。
（2）0.3%H2O2—甲醇10分钟，水洗。
（3）PBS洗3次。
（4）加生物素(Biotin)标记的特异性一抗，37。C30分钟，置湿盒内。
（5）PBS洗3次。
（6）加酶标记的卵白素（Avidin）, 37。C30分钟。
（7）PBS洗3次。
（8）DAB显色。
（9）流水冲洗，复染、脱水、封片。
2．桥式卵白素-生物素（BRAB）技术
（1）同LAB技术（1）--（5）
（2）加卵白素（Acidin）37。C30分钟。
（3）PBS洗3次。
（4）加酶标记的生物素(Biotin), 37。C30分钟。
（5）同LAB技术（7）--（9）
3．卵白素—生物素---过氧化物酶复合物（ABC）技术（三步法）
（1）同LAB技术（1）--（2）
（2）必要时胰酶消化，37。C30分钟。
（3）蒸馏水洗，PBS洗2次。
（4）正常羊血清（1：5-10）室温，10-20分钟。
（5）特异性抗体适当稀释，置湿盒中37。C60分钟或4。C过夜。
（6）PBS洗3次。
（7）生物素化（Biotin）第二抗体，37。C20分钟。
（8）PBS洗3次。
（9）ABC试剂，37。C30分钟，置湿盒中。
临用前将试剂A与试剂B等量混合，稀释为1：100的浓度，滴加于切片上。
（10）PBS洗3次。
（11）同LAB技术（7）--（9）
4．ABC快速法
在大量标本染色或快速切片的免疫组化染色时，可采用ABC快速染色法。
（1）同LAB技术（1）--（3）
（2）PBS洗3次。
（3）用含4%BSA和1%正常血清的PBS作用2分钟。
（4）特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液孵育15分钟。
（5）PBS洗3次。
（6）同LAB技术（8）--（9）
特异性抗体—生物素化IgG—ABC混合液的配制：于染色前30分钟用等体积的生物素化IgG—ABC混合，然后加入经适当稀释的特异性抗体。

5．PAP—ABC(ABPAP)技术
将PAP技术和ABC技术两者结合起来，连续应用，可提高敏感性。染色程序：
（1）切片脱腊入水。
（2）0.3%H2O2—甲醇10分钟，水洗。
（3）0.1% 胰酶消化37。C10--20分钟。
（4）PBS洗3次。
（5）与二抗相同的正常血清1：10，室温10分钟。
（6）滴加适当稀释的特异性抗体，4。C过夜，37。C复温30分钟。
（7）PBS洗3次。
（8）滴加桥抗体（如马抗鼠或氧抗兔IgG,1：200—400），37。C30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）滴加鼠PAP或兔PAP，1：200—500，37。C40分钟。
（11）PBS洗3次。
（12）生物素化IgG（如马抗鼠或氧抗兔）37。C20分钟。
（13）PBS洗3次。
（14）ABC复合物37。C40分钟。
（15）PBS洗3次。
（16）DAB显色，冲洗，复染、脱水、封片，观察。
二．葡萄球菌A蛋白免疫染色
1．SPA—HRP间接法
（1) 同LAB技术（1）--（3）
（2) 用TBS（PH7.6）洗3次。
（3) 滴加特异性抗体37。C60分钟，或4。C过夜。
（4) TBS洗3次。
（5) 滴加SPA—HRP（1：100—400）37。C30分钟。
（6) TBS洗3次。
（7) DAB显色。
（8) 流水冲洗，复染、脱水、封片。
1．SPA—HRP用于PAP法
（1) 切片脱腊至水洗
（2) 80%甲醇—0.6%H2O2封闭内源性酶5分钟。
（3) 10%卵白素Tris缓冲液洗，20分钟。
（4) 特异性抗体37。C30--60分钟，或4。C过夜。
（5) TBS（PH7.6）洗3次。
（6) SPA(1ug/ml)5分钟。
（7) TBS洗3次。
（8) PAP复合物（无种属限制）5分钟。
（9) TBS洗3次。
（10）DAB-- H2O2显色。Mayer’s苏木素淡染。脱水、透明、封片、镜检。
三．凝集素受体的检测步骤：
（1) 石蜡切片脱腊入水
（2) PBS洗3次
（3) 0.05%胰蛋白酶消化37。C，20分钟
（4) PBS洗3次
（5) 小鼠肝粉溶液（100ug/ml）或用1%BSA30分钟
（6) 生物素化凝集素37。C，60分钟
（7) PBS洗3次
（8) ABC试剂37。C40分钟
（9) PBS洗3次
(10)DAB显色，复染、常规封片
注意事项：
(1)市售凝集试剂，均为生物素标记，美国Vector公司生产的生物素植物凝集素有10种以上，在检测凝集素受体时，生物素化凝集素要进行适当稀释，以获得较好的显色效果。
(2)生物素化的凝集素需要用ABC或Avidin金标记抗体显示，才能检测出相应的受体，故ABC或Avidin金标记抗体也应有生物素化的凝集素相适应的稀释度，这也是保证显色效果的关键。