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1 引物设计由美国Perkin-elmer公司合成引物末端标记有生物素
1.1 扩增体系
10×PCR buffer 5μl
PCR引物 10μl
4×dNTP 10μl
Taq polymerase 0.25μl
DNA模板 10μl
D、W 14.75μl
Total 50μl
1.2 扩增程序（选用PE9600扩增仪）
变性 95℃ 30Sec
退火 63℃ 30Sec 32个循环
延伸 72℃ 30Sec
最后 72℃延伸10min
注意：扩增过程各设置阳性、阴性质控扩增。
2 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测
2.1 配制2%琼脂糖凝胶：4g琼脂糖溶于200ml×TBE缓冲液，微波炉中煮沸溶化使透明，冷却至60℃时加入10μl EB混匀。
2.2 将现配制好的琼脂糖溶化凝胶液灌入制胶模具，室温放置30分钟，使其冷却固化。
2.3 小心取出加样梳将已制好的凝胶放入水平式潜水电泳槽中，加1×TBE缓冲液使电极液高出胶面约1cm。
2.4 将标准DNA分子量Marker和DNA参照物，置于干热器孵育5分钟。
2.5 将DNA分子量Marker可见性DNA参照物及待测扩增样品5μl与上样缓冲液（loading buffer溴酚兰-二甲苯青兰）2μl混合后，按照从左向右顺序依次加入凝胶上样孔中。
2.6 150V电压电泳45分钟。
2.7 将电泳完毕的凝胶放置于紫外分析仪上，观察结果并照像，并与标准品对照，观察扩增效果。
3 LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC五位点DNA杂交。
3.1 流程示意：扩增DNA与固定在探针第六上的DNA探针杂交→洗涤除去非特异杂交的扩增DNA→HRP→SA与特异杂交的PCR产物结合→严格洗涤除去非特异结合的HRP-SA。
3.2 主要配制试剂
1）20×SSPE buffer(3.6M NaCl,200mM NaH2PO4·2H2O 20mM EDTA PH7.4)。
2）20% SDS
3）Hybridization Solution(5×SSPE,0.5% SDS)
4)Wash Solution(2.5×SSPE,0.1%SDS)
5)Enzyme Conjugate:HRP-SA
6)Chromogen:TMB Solution
3.3 探针设计：由美国Perkin-Elmer公司合成已制备成探针条。
4 操作步骤
2）步骤（以一个样本为例）
①扩增DNA 95℃变性10分钟。
②每个杂交槽中加入3.0ml H、S加入2μl 变性的扩增DNA，放入标记探针条（此步骤需在20秒内完成），55.5℃恒温水浴摇床孵育15分钟。
③弃去H、S，加5.0mlW、S洗数秒，弃去W、S。
④加3.0ml E、C、S液（3.0ml Hybridizition Solution,25μl Enzyme Corjugate:HRP-SA）,55.5℃孵化5分钟，弃去E、C、S液。
⑤加5.0ml W、S洗涤数秒，弃去W、S。
⑥加5.0ml W、S，55.5℃恒温水浴摇床洗涤12分钟，弃去W、S。
⑦加5.0ml W、S，洗涤数秒，弃去W、S。
注意：杂交缓冲液和洗液使用前固体成份必须55.5℃水浴完全溶解并混匀。
4 显色、判读结果并折照
4.1 主要配制试剂
1）Citrate buffer (0.1M Trisodium Citrate PH5.0)
2)Color Development Solution(用前10分钟内配制)
5.0ml Citrate buffer
5.0μl 3% Hydrogen Peroxide
0.25ml Chromogen:TMB Solution
4.2 操作步骤
1）5.0ml Citrate buffer于杂交槽，置Rocker platform上室温振荡5分钟，弃去Citrate buffer。
2）加5.0ml新配制Color Development buffer于每一杂交槽内，置杂交槽于Rocker platform上室温振荡20-30分钟（此步应蔽光）。
3）停止显色，弃去Color Development buffer,每槽内加5.0ml去离子水或蒸馏水，置于Rocker platform上室温振荡5-10分钟。
4）重复步骤3）至少两次，以降低探针条背景颜色。
5）将湿的已有分型结果DNA探针条置平滑黑色物体表面，观察判读结果并拍照。 |
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发表于 2007-5-27 14:33:52