Real－time 实验条件的优化

yujian623

实验方案优化：
由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致，所以优化的策略也不尽相同，然而在各种方案中，影响实时PCR 反应的因素却总是相通的。只要能较好地控制实验条件，优化实验步骤，要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的。下面就影响到实验结果的一些基本参数和实验步骤谈一谈关于实时定量PCR的优化。
1. 基本参数的优化：
1.1 MgCl2的浓度 在PCR反应中，MgCl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossing point)值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
1.2 模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I测定DNA时的条件优化：
2.1 MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4 mM。
2.2模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在10^6拷贝数左右选择。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释，但是在某些条件下，抑制子的浓度高，而模板量少，稀释法就不再能达到好的效果，反会使反应的敏感度降低，所以，研究者若要进行实时定量PCR研究，最好选用纯化的模板。
2.4 引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.5uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.3－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。
2.6 退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距。
3. 用SYBR Green I进行一步法RT－PCR的条件优化：
3.1 MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。
3.2模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternative RNA 作为载体进行测定。
3.3对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4. 杂交探针测定DNA
4.1 MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。
4.2杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。
4.4 其它的条件同SYBR Green I。
5 用杂交探针实时定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。
5.2杂交探针的浓度：初实验用0.2 uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列知释度的实验，在条件有困难的条件下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul）,则可加入MS2或alternative RNA作为载体。
5.4 对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。