分子克隆技术和载体

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一、核酸的纯化
　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。
二、核酸的浓缩
　　应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
　　具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15－30min，取出目测平衡，0－4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗涤离心2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。
单价阳离子盐溶液
　
贮存液(mol/L)  终浓度(mol/L)
(醋酸铵*  7.5  2.0－2.5
LiCl  8.0  0.8
NaCl  2.0  0.2
醋酸钠  3.0（pH5.2)  0.3
*：当加醋酸铵时，需加入DNA液的V/2。
单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。
三、DNA、RNA的定量
　　准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收，然后，按IA260相当于50μg/ml双链DNA。40μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度，即可大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。
四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物
（一）琼脂糖凝胶电泳
　　可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。
DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
浓度<%（w/v）  分离线状DNA分子的有关范围（Kb)
0.3  5-60
0.6  1-20
0.7  0.8-10
0.9  0.5-7
1.2  0.4-6
1.5  0.2-3
2.0  0.1-2
　
③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺浓度<%(w/v)>  有效分离范围（bp）
3.5  100-1000
5.0  80-500
8.0  60-400
12.0  40-200
20.0  10-100
聚丙烯胺凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克丙烯酰胺，1克双丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度的凝胶。每100ml上述液体加30μl四甲基乙胺（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温温箱内，以促进聚合。聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染米的迁移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中，标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同
标记染料在PAG中的迁移*
凝胶浓度（%）  溴酚蓝  二甲苯腈蓝
3.5  100  460
5.0  65  260
8.0  45  160
12.0  20  70
20.0  12  45
*这些数字是与染料共同迁移的DNA片段的近似大小（以bp计）。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。
（三）分子量参照物
　　为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。


分子克隆常用载体
　　DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。
一、质粒
常用的有pBR322，pUC系列质粒等。
（一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。
（二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
二、单链丝状噬菌体和噬粒
（一）大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组均是单链闭环DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RF DNA）。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ss DNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。
（二）噬粒（phagemid）在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外，还有 噬菌体和粘粒，详细情况可参阅有关资料。