细胞周期与DNA倍体分析总结

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在生物细胞核中，DNA含量并非恒定，随细胞增值周期时相不同而发生变化。
正常人静止细胞有46条染色体，相当于7×10-12 pg DNA/细胞核。在细胞周期的各个时期（G0、G1、S、G2、M），DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
整个细胞周期从DNA含量变化可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料标记DNA，荧光染料与细胞DNA分子特异结合，而且有一定的量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料结合量成正比，荧光强度与荧光直方图的通道数成正比。可以得到细胞各个周期时相的分布状态，计算G0/G1%、S%及G2/M%,了解细胞的增殖能力。
通常以S期细胞比例作为判断细胞增殖状态的指标。
正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞恶变过程中结构和（或）染色体数目异常较常见，这种变化在流式细胞分析中可以DNA倍体指数（DI)进行评价。DI可作为肿瘤的早期诊断，交界瘤等良恶性判断指标。
在流式细胞分析DNA中，只有在染色体数目变化引起DNA含量与正常细胞有差异时，才可能有DNA异倍体检出。在DNA含量未见异常并不能除外恶性肿瘤或染色体异常的存在。

基本概念
1. 变异系数（CV）
流式细胞分析的高分辨率或精密度可检出不同细胞群体DNA含量的细微差别，通常的检测分辨率或精密度由DNA含量直方图中G0/G1峰的CV来反映。CV越小，质量越好。新鲜标本CV常≤3%，石蜡包埋标本的CV≤5%。

2DNA index （DI）  
指样本G0/G1峰的平均荧光道数与人正常二倍体细胞样本G0/G1峰的平均荧光道数之间的比值。
    DI=1.0±0.1（0.90～1.10）为二倍体
    DI=1.0±0.15（0.85～1.15）为近二倍体
    DI=2.0±0.1（1.90～2.10）为四倍体
    DI＞2.10为多倍体。
    其余DI值均为非整倍体

3. 倍体（ploidy）原指染色体数目。流式细胞分析中用来描述总的 DNA总量。
与正常人细胞的荧光道数位置一致的DNA单峰定义为DNA二倍体。二倍体细胞（diploid cells）的DNA含量正常，但染色体可能存在异常。
DI为1.9～2.1的细胞为四倍体。四倍体峰的DI应为1.90～2.10，
在此范围外的峰应报告为DNA非整倍体。

精确判断肿瘤DNA倍体的关键在于G1峰的CV值。CV越小，能检测到的偏移就越小，正常和肿瘤细胞就更容易分辨。
若有一个峰处于4c为止，同时出现8c峰和两峰之间的S期细胞，肿瘤应报告为四倍体。如果没有8c峰和S期细胞，但4c位置的细胞数超过正常组织G2/M期细胞比例标准差的3倍，则可谨慎地报告四倍体，同时一定要保证G2/M处的细胞不是细胞聚集的人工假象。

在淋巴瘤和白血病样本中，正常细胞可能很少。偏移预期正常二倍体位置±5%的单一峰应怀疑为非整倍体。如果加入DNA标准细胞或进行肿瘤细胞选择性抗体标记，可确认非整倍体，否则应谨慎报告。
样本制备

1. 制备  获得含尽可能少碎片和聚集体的单个细胞或细胞核。制备方法取决于样本及其保存方式。
新鲜或新鲜冰冻标本：  白血病标本、穿刺液很容易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。
新鲜固定标本： 乙醇或甲醛固定。标本切成1～2mm2的小块，在含胃蛋白酶的0.1mol/L HCl液中孵育或用胰蛋白酶处理，使其释放细胞核。
甲醛固定、石蜡包埋的标本： 从包埋组织上切片至少50μm厚，太薄的切片会含有太多切碎的核，从而增加DNA直方图的碎片干扰。组织切片被脱蜡、经过乙醇处理并水化后，用蛋白水解酶处理，使其释放细胞核。

2． 固定  
采用70%预冷乙醇(0~4°C)。
运送标本时应保证样本完全浸没在固定剂中。
若同时使用抗体鉴别肿瘤细胞应选择对抗原无损的固定剂，并在抗体标记之后进行固定。

3．染色
  染料的选择取决于流式细胞仪激光的配置。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。

4．细胞浓度
单细胞或细胞核的最终浓度应为 106/ml。浓度太  低时，流式细胞仪检测室样本的流速不得不提高，从而使CV增大。如果细胞或细胞核浓度太高，则可能导致染料的相对不足，影响CV和检测结果。
5．样本制备的质量
制备完成后的标本可用光学显微镜，最好是荧
显微镜检查其质量，注意观察：
   样本中细胞或细胞核浓度
   细胞聚集或过多的碎片
   大多数核有肿瘤样的外观
   分离的核上没有参与细胞质附着

应用PI染色液。染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度至少为20ug/106细胞。
由于PI也与双链RNA结合，分析前样本应用RNase处理。
细胞用50um尼龙网过滤后上机检测。