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一、 生化标记
60年代初出现了同工酶标记。可从蛋白质水平来反映生物的遗传变异。同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。具有组织、发育及物种的特异性。其基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同基因型。由于其经济方便，易于操作，受到广泛的应用。
二、 常用DNA分子标记的基本原理及其应用
依据多态性的检测手段，分子标记可分为二大类：1)基于southefn杂交技术的分子标记如RFLP、染色体原位杂交；2)基于PCR反应的分子标记如AFLP、RAPD、DAF、SSR、STS、SSLP等。依据在基因组中出现的频率，又可将分子标记分为低拷贝序列和重复序列，重复序列包括串联重复和散布重复。
基于Southern杂交拉术的分子标记
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)
RFLP是最早发展的分于标记，至今仍被广泛应用。RFLP分为两种类型：一类是由于限制性内切酶位点上发生了单个碱基突变而使这一限制性位点发生丢失或获得而产生的多态性，故称之为点多态性(point polymorphism)，这类多态性实际上是双态的。即有(十)或无(一)。另一类是由于DNA分子内部发生较大的顺序变化所致，这类多态性又可分为两类：第一类是由于DNA顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致；第二类是近年发现的“高变区”，高变区(highly variable region)是由多个串联重复序列组成的不同的个体高变区内所串联重复的拷贝数相差悬殊，因而高变区的长度变化很大，从而使高变区两侧限制性内切酵识别位点的固定位置随高变区的大小而发生相对位移，所以这一类型的RFLP是由于高变区内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因中的相对位置。RFLP的基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，与同位素或非同位素标记的探针杂交，探针为单拷贝或低拷贝的DNA克隆(cDNA或基因组DNA)，从而显示与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异。RFLP标记呈孟德尔遗传，不受环境影响，是一种共显性标记，可区分纯合基因型和杂合基因型；非等位的RFLP标记之间不存在上位效应；结果稳定可靠，重复性好。
染色体原位杂交(Chromosome in situ bybridlzation)
染色体原位杂交是细胞学方法和分子杂交相结合的产物，是指利用特异性核酸片段作探针，直接同染色体的DNA片段杂交．在染色体上显示特异的DNA或RNA。原位杂交的优点是准确直观，在整个基因组DNA或基因组特异重复序列作探针时，可以明显区分不同物种的染色体组成，在鉴定远缘杂种染色体构型和结构变异、物种起源演化方面有重复作用。
基于PCR(Polymerase Chain Reaction)分子标记
PCR反应技术的问世，推动了分子标记进一步发展，与RFLP相比，它需要的DNA量较少，可检测ng水平；不需要同位素，安全性好，较便宜，快速易行，易于自动化。
随机扩增片段长度多态性(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)标记
RAPD技术是由Williams和Welsh(1990)首先提出[7-8],是利用一个随机引物，通常为10个核苷酸，以生物的基因组DNA作模板进行PCR扩增反应。经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。RAPD标记检测灵敏、方便、多态性高，可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序区，可填补RFLP图谱的空缺,适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因的分子标记、遗传图谱的快速构建等研究。但是RAPD标记为显性标记，不能有效鉴别杂合子，易受反应条件的影响．稳定性较差。
DNA扩增指纹分析(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)
DAF技术是利用非常短的随机引物扩增不同个体的DNA，然后采用高分辨的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测DNA多态性。DNA使用引物为7~8bp，比RAPD反应更短，因而扩增产物更多，最近DAF技术得到进一步改进：1)内切酶消化模板DNA；2)使用微发夹引物，从而成倍增加可以检测的DNA多态性。DAF提供消息远远高于RAPD分析，但技术较为复杂。
序标位(Sequence Tagged site，STS)
STS最早由Olson M提出，它是根据单拷贝的DNA片段两端的序列设计一对待异引物扩增基因组DNA，由一般长度为200一500bp的序列所界定的位点，在基因组中只出现一次。任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的界标转化为STS标记，获得STS的方法是将单拷贝的克隆DNA从两端测序，设计一对专门扩增引物(大约20bp)特异性扩增这一段序。STS的突出优点是共显性遗传方式，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记转移，在人类基因组作图中已获得21000个标记，它们是将遗传图谱和物理图谱整合的有力中介。
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymophiam，AFLP)
AFLP技术是一项新的DNA指纹技术，是由Zabcan发现，并由Vos发展起来，是一种选择性扩增限制性片段的方法，结合了RFLP和PCR的优点，其原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物接合点，限制性片段用两种酶切割，一种是罕见的切割酶，一种是常用的切割酶。AFLP技术包括三个步骤：1)DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头(adapter)连接，2)利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5~1微克；3)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于APLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。
酶切扩增多态性序列(C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)
CAPS是一类以PCR为基础的共显性的分子标记，它的基本原理是先用已知位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物(19~27bp)。然后应用这些去扩增该位点上的某一DNA片段；接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。1993年Konieczny和Ausubel首先在拟南芥两种不同的生态型Columbia和Landsberg之间发展出了18套这样的CAPS标记。根据TAIR(The Arabidopsis Information Resource)最新公布的信息。在拟南芥中又有53套新的CAPS标记被鉴定出来。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息，特异引物序列来自基因数据库、基因组克隆或cDNA克隆以及克隆的RAPD条带。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)
单核苷酸多态性是指同一位点的不同等位基因之间只有一个核苷酸的差异或只有小的插入、缺失。SNP作为一种新的分于标记，目前已有2000多个标记定位于人类染色体上，在拟南芥上已发展出236个SNP标记。在这些sNF标记中大约有30％包含限制性单核昔酸多态性位点的多态性，可以转化为CAPS标记。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(microchip electrophoresis)，可以高速度的检测临床样品的SNP，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10倍和50倍。SNP的优越性表现在位点的丰富性以及多种非凝胶基础上的SNP的检测手段。
重复序列标记
SSR标记 SSR (Simple Sequence RePeat)
即简单重复序列，又称微卫星DNA。它是基因组中的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸的简单串联重复。SSR标记具有多态性高的特点，需要DNA的量很少，比较适合育种工作。水稻中的SSR研究始于1993年，由于SSR标记位点具有高水平的等位基因多样性，表现为共显性的孟德尔遗传，简单重复序列长度多态性很容易通过PCR快速扩增和高分辨率的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，经济便捷，己发表的引物序列从相关的实验室易于获得。多数SSR引物已经进行了染色体定位与作图，使其很快地从多种分子标记中脱颖而出，甚至被有关学者称为第二代分子标记(Daviesl993)。SSR标记在水稻中的研究很多，发表的文章也很多。不过要克隆足够的SSR并对其进行测序和设计引物，工作量很大，费用也非常高。
总结：本文全面分析了各种应用于水稻遗传的分子标记技术。需要指出的是水稻杂种优势的遗传基础是一个比较复杂的问题。控制表型性状的基因是间接发生作用。从基因到性状要经历基因的转录、翻译、生理代谢、细胞和组织的构建、形态发生的过程。性状形成是细胞内外环境的综合表现。很难用少数形态分类性状和有限的分子标记位点的差异研究就能够解释的。但是分子标记却为我们进一步了解水稻基因结构和遗传育种提供了有限方法和手段。 |
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发表于 2006-9-22 17:25:52
