冠心病基因治疗研究进展

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过去的20余年中，随着血管内介入治疗技术的产生和不断发展、完善，冠心病的治疗学发生了巨大的变革。尽管如此，冠心病治疗的研究还远未达到理想的目的地。一方面，临床上有相当一部分冠心病患者由于各种原因不适宜接受介入治疗或外科手术，而单纯药物治疗效果不佳，对于这些患者的治疗是目前冠心病治疗的难点，也是近年来研究的热点。另一方面，对于冠心病发病机理的认识还在不断深入之中，尤其是对动脉粥样硬化的防治也是冠心病治疗研究的重要方面。基因治疗和细胞治疗作为全新的治疗手段，可能为冠心病的治疗开辟新的途径。
第一节  冠心病的基因治疗
一．概述
基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”，装配于能使其在人体细胞中表达的特定载体中，导入人体细胞，并表达相应的蛋白质，实现其生物学效应。
基因治疗是近10年来疾病治疗学中新的热点，目前研究较多的领域是遗传性疾病和肿瘤，而心血管疾病也是基因治疗研究的重要方面。1993年，Wilson等应用低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因治疗家族性高胆固醇血症，这是基因治疗首次在心血管病相关领域实现临床应用。近年来，心血管病基因治疗占全部基因治疗临床研究的比例逐渐增加，在美国，该比例从1994年的3%上升至2000年的17%；基因治疗的对象也从单基因遗传的心血管病扩展到多基因心血管病，如高血压病和冠心病，有望为这些疾病的治疗开拓一片新的天地。表7-40-1显示经不完全统计截止2002年全球基因治疗临床研究方案的疾病分布现状（引自The journal of gene medicine，http://www.wiley.co.uk/genmed）。
（一）基因治疗的途径
根据不同的疾病和治疗基因产物的不同性质，基因治疗有两种途径：
1．Ex vivo 途径:指将携带治疗基因的载体在体外导入人的自体、异体或异种细胞，细胞经体外扩增后输入人体。在能够容易地获取细胞、在体外操控并重新导入患者体内的情况下，适于采取Ex vivo 途径，这一途径在血液病或免疫缺陷病的治疗中有潜在的应用价值。
表7-40-1 基因治疗临床研究方案的疾病分布
疾病  方案数
  数量  百分比(%)
肿瘤  403  63.4
单基因遗传病  78  12.3
感染性疾病  41  6.4
血管疾病  51  8
其它疾病  12  1.9
基因标记  49  7.7
健康志愿者  2  0.3
总计  636  100

2．In vivo 途径：指将治疗基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这是目前基因治疗研究中更常采用的方式。In vivo途径的主要优势在于可以针对不易从体内取出的细胞进行治疗，而选择适当的基因导入方法是问题的关键。
（二）基因治疗的载体
为将一种基因转移入适当的细胞需要一个载体。当转移的目的是添加一个基因以使受体细胞获得原来不具备的功能时，典型的载体应包括编码治疗蛋白的DNA序列以及基因表达所需的转录调节元件。基因治疗的常用载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。
1. 病毒载体：病毒载体均经过基因工程处理，通过转染的过程将治疗基因转移入细胞内。病毒载体在基因转染效率方面有很大优势，但载体本身的安全性仍是目前关注的主要问题之一。表7-40-2简要介绍了目前常用病毒载体的特点和应用。
2. 非病毒载体：非病毒载体是由核酸与其它化学物质形成复合物以易化基因转移。非病毒载体毒性小、无免疫原性，制剂可高度浓缩，但多数非病毒载体的基因转移效率远远低于病毒载体，且缺乏靶向性、只能作用于给药局部，影响了其广泛应用。常见的非病毒载体包括：
(1) 裸DNA：通过直接的物理或机械方法导入，转染效率低，但近年的研究显示，可以通过局部给药与电脉冲、超声波等结合以提高转染效率。
(2) 脂质体载体：用脂质体包裹DNA，利用脂质体促进极性大分子穿透细胞膜的原理介导DNA进入细胞，基因转移效率较高。
(3) 多聚物/DNA复合物：由阳离子多聚体与DNA形成复合物，提高DNA稳定性，复合体带正电荷，与细胞表面带负电荷的受体结合，促进DNA内吞。其合成简便，但基因转移效率仍较低。
迄今为止进行的600余项基因治疗的临床试验中，病毒载体的应用仍占主导地位，这主要与非病毒载体难以达到理想的基因转移效率有关；非病毒载体中，脂质体由于基因转移效率高而得到较多的应用。但近年来，特别是在冠心病基因治疗的研究中，裸质粒作为治疗基因的载体显示了良好的作用。在冠心病基因治疗中应用的多为分泌性蛋白基因，即使转染细胞的效率低至1%，仍然可以获得理想的生物学效应，这就克服了裸质粒转移效率低的不足，为这种具有良好安全性的载体提出了应用前景。表7-40-3总结了目前基因治疗临床试验中各种载体的应用情况（引自http://www.wiley.co.uk/genmed）。
表7-40-2 基因治疗常用的病毒载体
载体  生成  细胞周期
的影响  基因状态  表达  毒性  应用
逆转录
病毒  生产简单，滴度低，约106颗粒／ml  依赖细胞分裂  随机整合  持久  安全  广泛，在非分裂组织可通过Ex vivo途径
腺病毒  生产简易，滴度达1013~1014颗粒／ml  静止或分裂细胞  染色体外  暂时  最初的载体有毒性，后有很大改善  广泛
腺相关
病毒  生产困难,滴度可达1012颗粒／ml  静止或分裂细胞，存在DNA合成可能有帮助  定向整合或染色体外  较持久  安全  遗传病和慢性获得性疾病
单纯疱疹病毒  滴度高  静止或分裂细胞  染色体外  暂时，在神经原中可潜伏感染  尚需完善  神经系统疾病，包括肿瘤

表7-40-3 基因治疗临床研究方案中载体的应用情况
载体  方案数
  数量  百分比
腺相关病毒  15  2.4
腺病毒  171  26.9
基因枪  5  0.8
单纯疱疹病毒  5  0.8
脂质体  77  12.1
裸质粒  70  11
痘病毒  39  6.1
反转录病毒  217  34.1
RNA  6  0.9
N/C  25  3.9
总计  636  100

二． 冠心病基因治疗研究进展
在人类已经进行的600余项基因治疗的临床试验中，心血管病的基因治疗仅占8%左右，但迄今为止却是基因治疗成功率最高的领域。近年来这方面的研究进展可以说是一日千里，与冠心病相关的基因治疗研究更是其中最受关注的部分。冠心病基因治疗进展迅速的原因可能有几个方面：① 作为目前威胁人类健康的主要疾病，冠心病的患病率和死亡率都以惊人的速度增长，而在冠心病的治疗中仍有许多未能解决的疑难问题，迫切需要新的治疗方法的出现；② 在针对冠心病的基因治疗研究中，治疗基因的表达通常仅须持续数周即可发挥满意的疗效，大大减少了副作用的发生，因而与遗传病基因治疗中通常采用的终生替代治疗相比在安全性方面有更多优势，有利于临床研究的顺利进行；③与肿瘤治疗所要求的治愈标准相比，冠心病基因治疗的终点可以是非治愈性的。
目前冠心病基因治疗的研究主要涉及三个方面：动脉粥样硬化防治、治疗性血管生成和血管成形术后再狭窄的防治。其中对于治疗性血管生成的研究进展最为迅速，目前已经进行了大量临床试验，是目前疾病基因治疗中最成功的领域之一，本节将主要介绍这部分研究的进展。
（一）动脉粥样硬化的基因治疗
近年来动脉粥样硬化防治的思路主要可以分为两个方向：一个方向是调节脂质代谢异常，另一方向则关注细胞损伤、细胞增殖及炎症等其它粥样硬化相关的机制。基因治疗研究绝大多数还处在动物实验阶段，表7-40-4列举了部分目前应用于动脉粥样硬化防治研究的基因。
由于动脉粥样硬化是一个多因素共同作用的复杂病理过程，虽然动物实验提供了很多可能的治疗靶点，但在现实的人体环境中类似的治疗能否真正发挥作用尚为未知，除了前述LDL-R基因治疗家族性高胆固醇血症的方法[1、2]被应用于临床以外，迄今尚没有其它治疗基因的应用进入临床试验。
（二）治疗性血管生成
自20世纪80年代以来，随着血管内介入治疗（PCI）和冠状动脉旁路移植术（CABG）的不断发展完善，越来越多的冠心病患者得到了有效的治疗。但现有的治疗手段仍不能满足所有患者的需要。一部分内科药物治疗无效，而又因各种原因被确认不适宜接受CABG或PCI治疗的患者仍然求助无门，为这部分患者的治疗寻找新的途径，是目前心血管病治疗研究的重要课题。
表7-40-4 动脉粥样硬化基因治疗的实验研究
基因  生物学功能和作用机制  参考文献
apoE  被肝细胞受体识别，加速血液中LDL的清除；将胆固醇与血管壁隔离；局部抗氧化、抗血小板、抗炎症作用  1995  Arterioscler Thromb Vasc Biol; 15:479
   1995  J Clin Invest;96:1612
   2000  Hum Mol Genet;9:2545
   2002  Gene Ther;9:21
apoA-I  激活LCAT，接受细胞游离胆固醇，促进细胞内胆固醇的清除  1994  Proc Natl Acad Sci U S A; 91: 9607
   1999  Circulation;99:105
   1999  Circulation;100:1816
   2001  J Biol Chem;276:36742
   2002  Atherosclerosis;165:15
LCAT  促进游离胆固醇转移入脂蛋白，提高血浆HDL水平  1996  Proc Natl Acad Sci U S A; 93: 11448
   2000  Arterioscler Thromb Vasc Biol; 20:450
LPL  促进富含甘油三酯的脂蛋白分解，降低血浆甘油三酯和VLDL水平，预防动脉粥样硬化的发生  1997  Hum Gene Ther;8:1921
   1997  Arterioscler Thromb Vasc Biol 17:2532
   1999  J Lipid Res;40:1677
LDL受体  降低血浆胆固醇水平，提高血浆HDL水平  1991  Science;254:1802
   1993  J Clin Invest;92:883
   1995  J Clin Invest;95:768
   1999  Gene Ther;6:34
   2000  J Gene Med;2:41
VLDL受体  降低血浆LDL/IDL水平  1996  Nat Genet;13:54
   1996  J Biol Chem;271:6852
Lp特异的核酶  抑制LpmRNA，降低血浆Lp水平  1998  Circulation;98:1898
ApoB mRNA编辑蛋白  抑制ApoB生成，降低血浆LDL水平  1996  Hum Gene Ther;7:943
IL-18结合蛋白  阻断IL-18的作用，抑制粥样斑块的进展，增加斑块稳定性  2001  Circ Res;89:E41
HO-1  具细胞保护和平衡离子稳态的作用，抑制动脉粥样硬化的发展  2001  Circulation;104:1519
N-末端缺失突变的MCP -1基因  阻断MCP-1的作用，抑制单核细胞的浸润和活化  2002  Circulation;106:2700
LCAT: 卵磷脂胆固醇酰基转移酶; HO-1:血红素加氧酶-1;
LPL: 脂蛋白脂肪酶

随着心血管基础研究的进展，人们对心脏血管生成的过程有了逐渐深入的认识。近10余年以来，人们发现一些多肽生长因子具有促血管生成作用；在闭塞性血管病的研究中，外源性给予这些生长因子可以有效地促进新生血管形成及缺血组织的侧支循环建立，改善组织缺血，这一新的治疗策略被称为“治疗性血管生成（Therapeutic angiogenesis）”。对于严重冠心病的患者来说，这种治疗策略无疑是一个新的希望。本节对血管生成的机制及治疗性血管生成的研究现状作一简要介绍。
1．血管生成的分子基础：血管生成是一个具有重要生理、病理意义的过程。血管生成是胚胎发育中的关键过程，通过各种方法阻断胚胎的血管生成会导致胚胎的死亡。在成体的创伤愈合、炎症反应、器官再生过程以及肿瘤生长转移、血管增生性疾病中血管生成也有重要的作用。了解血管生成的过程，我们可以有目的地促进或抑制这一过程，从而治疗相关的疾病。
血管生成过程可以分为两个阶段：Vasculogenesis和Angiogenesis。前者主要发生在胚胎期，包括血管内皮细胞前体细胞的分化、增殖、迁移，融合成初期血管网络；后者包括血管的芽生、分支、形成小血管以及血管支持细胞的聚集、细胞基质的分泌，最终形成成熟的新血管。血管生成的过程受多种分子的调节，总的来说包括血管生成促进因子和血管生成抑制因子两大类，血管生成的过程就是这两类分子共同作用、不断平衡的结果。表7-40-5列出了目前已知可能参与血管生成过程的调节分子。
表7-40-5 血管生成过程的调节分子
血管生成促进因子  血管生成抑制因子
蛋白  报道
年份  参考文献  蛋白  报道
年份  参考文献
FGF-1  1985  Biochemistry;24:4969  INF-α  1980  Science 208:516
Angiogein  1985  Biochemistry 24:5494  血小板因子4  1982  Nature 297:307
FGF-2  1986  Science.233:545  催乳素片段  1993  Endocrinol 133:1292
TGF-α  1986  Science 232:1250  血管他丁  1994  Cell 88:277
TGF-β  1986  Proc Natl Acad Sci USA. 83:4167  2-甲氧雌二醇  1994  Proc Natl Acad Sci 91:3964
TNF-α  1987  Proc Natl Acad Sci USA. 84:5277  PRP  1994  Science 266:1581
VEGF  1989  Science 246:1306  白细胞介素12  1995  J Natl Cancer Inst 87:581
PDGF  1989  Nature 338:557  可诱导蛋白 10  1995  J Exp Med 182:155
PGF  1991  Proc Natl Acad Sci USA 88:9267  内抑素  1997  Cell 79:315
白细胞介素8  1992  Science 258:1798  Vasostatin  1998  J Exp Med 188:2349
HGF  1993  Symp Soc Exp Biol. 47:227  PEX  1998  Cell 92:391
多育曲菌素  1994  Science 266:1581  肌钙蛋白I  1999  Proc Natl Acad Sci 96:2645
Ang-1  1996  Cell 87:1171  PEGF  1999  Science 285:1926
瘦素  1998  Science 281:1683  Restin  1999  Biochem Biophys Res Commun 255:735
    Id1 和 Id3  1999  Nature 401:670
    VEG1  1999  FASEB J 13:181
    Canstatin  2000  J Biol Chem 275:1209
    Maspin  2000  Nat Med 6:196
注：FGF-1: 酸性成纤维细胞生长因子； Angiogein：血管生成素；FGF-2：碱性成纤维细胞生长因子； TGF-α：转化生长因子α；TGF-β：转化生长因子β；TNF-α：肿瘤坏死因子α；VEGF：血管内皮生长因子；PDGF：血小板源生长因子； PGF：胎盘生长因子；
PRP：多育曲菌素相关蛋白； （INF-α：干扰素α；HGF：肝细胞生长因子；
Ang-1： 促血管生成素-1；PEGF：色素上皮生长因子。

（1）血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）：VEGF事实上是一族结构上具有同源性的蛋白，目前发现的有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E。VEGF家族均具有信号肽序列，可以主动地分泌至细胞外而发挥生物学效应。经典的VEGF即VEGF-A 是相对特异的血管内皮细胞促有丝分裂原，由于其同时具有增加血管通透性的作用，又被称为血管通透因子。VEGF-A有5种异构体：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，它们具有相似的生物学活性。大多数细胞能够同时产生多种VEGF-A异构体，其中以VEGF121和VEGF165为主要形式。除VEGF-A以外，目前发现VEGF-B和VEGF-E均有促进血管生成的作用；VEGF-C和VEGF-D则可能对于淋巴管生成有重要作用。
VEGF通过与细胞表面的特异受体结合而发挥作用。目前发现的高亲和力的VEGF受体已有3种。VEGFR-1（flt-1）和VEGFR-2（flk-1/KDR）主要在血管内皮细胞表达，在人的冠状动脉内皮细胞和心肌组织中均有高水平的表达，提示VEGF在心血管系统的功能主要以旁分泌和自分泌的形式实现。VEGFR-1和VEGFR-2在胚胎血管形成中有重要作用，VEGFR-2介导内皮细胞的分化增殖，VEGFR-1对内皮细胞组装成正常的血管是必须的。VEGFR-1主要结合VEGF-A和VEGF-B;VEGFR-2可与VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E结合;VEGFR-3（Flt-4）可能介导淋巴管的生成,它的配体是VEGF-C和VEGF-D。
VEGF促进血管生成的机制尚不完全清楚。促进血管内皮细胞增殖只是VEGF作用的机制之一。Gerber等[11]发现，VEGF能够诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达抗凋亡的Bcl-2蛋白，抑制细胞的凋亡，提示抑制血管内皮细胞的凋亡可能也是VEGF促血管生成的一种机制。近期研究发现血管平滑肌细胞也有VEGFR-1的表达，VEGF可诱导SMC迁移，对肌性血管的形成可能有一定作用；VEGF还能够促进SMC合成和分泌基质金属蛋白酶（MMP），通过加速细胞基质的降解而促进血管生成。另外，VEGFR-1在单核细胞也有表达，介导VEGF对炎症细胞的趋化反应，与炎症细胞在血管生成中的作用有关。总的来看，VEGF对血管生成过程中多个环节均具有调节作用。
（2）成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）：FGFs是一组强大的促细胞分裂物，其靶细胞包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等，因此它对于血管壁细胞的作用是非特异的。在心血管系统的研究中涉及最多的是aFGF和bFGF，其中bFGF是最早被纯化和测序的促血管生成因子。FGFs通过刺激血管内皮细胞迁移、促进细胞基质降解和平滑肌细胞增殖等功能参与血管新生的过程。FGFs在多种组织均有表达，在正常的心肌中有FGFs蛋白的存在。正常的成人心脏组织有FGF受体的表达。
（3）促血管生成素（Angiopoietin）：angiopoietins及其受体Tie-2是近年发现与胚胎和成体血管生成有重要关系的系统。angiopoietins目前已知有4个成员，其中对angiopoietin-1和angiopoietin-2的研究较多。
研究发现，Tie-2基因缺陷的胚鼠的血管组织具备正常数量的内皮细胞、可组装成管道，但内皮细胞与细胞基质的连结松散，血管旁细胞聚集不良，内皮细胞管道不能进一步重塑而形成成熟的血管；angiopoietin-1基因缺陷的小鼠也具有类似的表现。这提示angiopoietin-1通过Tie-2发挥其生物学作用，它的作用是保证新生血管内皮细胞的正确组装、促进血管支持细胞的聚集和血管的重塑，从而维持新生血管的稳定性。Chae等的研究也证实，angiopoietin-1不能刺激内皮细胞增殖，但具有促进内皮细胞迁移、芽生、促进纤溶酶和MMP分泌的作用，是血管生成过程的重要促进分子。
（4）其它：血管生成素（Angiogenin）是胰RNA酶超家族成员，与RNase4同源，是一种肯定的血管生成促进因子。它促进血管生成的可能机制是调节血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，通过与细胞表面的肌动蛋白结合而发挥增强纤溶酶活性、促进细胞基质蛋白分解等作用。
肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）是一种间质衍生的生长因子，具有促进成体肝细胞再生的作用。近年来的研究显示，HGF能够促进血管内皮细胞的增殖，并且可能通过直接促进内皮细胞增殖以及促进其它促血管生成因子如VEGF水平的上调而发挥促进血管生成的作用。
瘦素（Leptin）是肥胖基因（OB基因）编码的蛋白，近年来发现它同时具有促进血管生成的作用，在正常组织和病变组织（如动脉粥样硬化斑块）均有表现。Leptin促血管生成的机制尚不清楚，可能包括促进血管内皮细胞增殖及调节细胞基质的重构。
2．心脏侧支循环建立与生长因子的作用：成体心脏侧支循环建立的过程主要包括两个方面：angiogenesis和arteriogenesis。在慢性心肌缺血的动物模型中，可以观察到心肌内毛细血管的“出芽”现象和密度增加，以及侧支循环依赖区域的毛细血管阻力降低，即angiogenesis的表现。同时，arteriogenesis是心肌内潜在的无功能侧支血管开放，重塑为有功能侧支血管的过程，这一过程同样也涉及细胞基质降解、血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润等血管生成的重要环节。目前的研究已经显示，在众多的促血管生成因子中，一部分与心脏侧支循环的建立有密切的关系，在心肌缺血的治疗中可能发挥一定作用，以下仅举例说明。
（1）血管内皮生长因子：正常的心肌细胞中有VEGF mRNA的持续表达；在缺氧条件下，心血管系统的多种细胞，包括心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，均表现VEGF mRNA表达水平的显著上调，提示VEGF在心血管系统对缺氧的反应中可能有重要的意义。
在体动物实验显示，无论是心肌的短暂缺血、持续慢性缺血还是急性心肌梗塞时，在缺血心肌或梗塞边缘的心肌组织中均可以发生VEGFmRNA表达的迅速上调，伴随VEGF受体表达的增加，特别是在缺血、梗塞区及其周围的微血管中可以发现VEGF及其受体表达的显著增加，这种变化在梗塞后数小时即可出现，而且在缺血区域新生血管中的表达可以持续长达6～7周的时间。在人体的观察也发现，急性心梗后1～2周血浆VEGF水平明显上升，可以达到刺激内皮细胞增殖的水平。这些研究显示心肌缺血可诱导VEGF及其受体表达的迅速增高，而这种变化有一定的时间和空间分布，因而可能参与缺血组织侧支循环建立的过程。VEGF及其受体水平的上调可以认为是机体对组织缺血的一种代偿机制，但在正常情况下，仅依靠机体自身的代偿，很难在较短的时间内为缺血组织建立有效的侧支循环；这时，给予外源的VEGF可能通过加速侧支循环建立的过程而起到治疗作用。
缺氧时VEGF表达上调的机制可能与其它一些缺氧诱导基因（如促红细胞生成素基因）类似，在VEGF基因的启动子序列中含有一个缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）序列,在缺氧时可诱导VEGF mRNA的表达。此外，增加VEGF mRNA的稳定性也是其上调的原因，例如在培养细胞中发现的一种因子HuR即可在缺氧条件下特异地增加VEGF mRNA的稳定性。
（2）成纤维细胞生长因子：有证据表明FGFs与心肌缺血时侧支血管的形成相关。在猪慢性心肌缺血模型中，心肌局部坏死的区域可以检测到aFGF；急性心肌梗塞的狗心肌中bFGF的活性在梗塞后1-8周升高，与侧支血管增加的过程一致。在人体的观察显示，不稳定心绞痛的患者心包内bFGF水平显著高于无心肌缺血证据的正常人；急性心梗的患者血浆bFGF的水平在心梗后10天升高，30天时方回到正常水平，与侧支血管形成的过程平行，这些均提示bFGF可能是心肌缺血和坏死时侧支形成的促进因素。对冠心病患者冠脉侧支循环水平与冠脉内VEGF和FGF的浓度进行相关性分析，发现VEGF与FGF含量的总和与该支冠脉侧支血管分级正相关，直接提示两种生长因子对冠心病患者侧支循环的建立有重要作用。
（3）促血管生成素：Ray等将大鼠在缺氧环境中饲养不同时限（1-4小时）后再正常饲养24小时，观察心肌VEGF及其受体VEGFR-2和angiopoietin蛋白表达的变化。研究发现，除了VEGF及VEGFR-2表达的上调外，angiopoietin的表达也有变化：缺氧1小时组心肌angiopoietin-1和angiopoietin-2的表达均显著上调；随着缺氧时间的延长，angiopoietin-1的表达逐渐增高，而angiopoietin-2的表达则逐渐回降。缺氧4小时的大鼠在7天后处死时，心肌内毛细血管的数目显著高于无缺氧的对照组。这提示，angiopoietin-Tie系统可能与VEGF及其受体系统共同作用于心肌缺血时新生血管形成的过程。
3．治疗性血管生成的应用研究：目前，应用促血管生成因子的基因治疗心肌缺血是心血管病基因治疗研究中最活跃的部分之一,被应用的目的基因包括VEGF基因、FGF基因、HGF基因，Ang-1基因是另一有希望的基因。由于心脏侧支循环的建立是一个多环节、多因素作用的过程，联合基因治疗也是目前研究的方向之一。
（1）VEGF基因：VEGF基因是迄今为止在冠心病治疗研究中应用最多、疗效最理想的基因。VEGF基因治疗之所以能够取得满意的结果，与VEGF本身的一些特点密切相关。首先，VEGF是一个相对特异性的血管内皮细胞的促有丝分裂原，在促进血管内皮细胞增殖的同时，对血管壁的其它细胞如平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖没有影响，因此可以避免在发挥促血管生成作用时引起血管内膜异常增生等副作用。其次，VEGF为分泌性蛋白，有信号肽序列，合成后分泌到细胞外，以旁分泌或自分泌方式作用于靶细胞的VEGF受体，较低的基因转移效率就可以实现满意的生物学效应，是基因治疗的理想选择。另外，在促血管生成的治疗中，基因表达维持3-4周即可达到治疗目的，且分泌性蛋白对基因转移效率的要求不高，所以在VEGF基因治疗中，裸质粒载体可以获得与病毒载体相近的疗效；而与病毒载体相比，裸质粒无疑具有安全性方面的优势，有利于临床研究的开展。迄今为止，裸DNA介导VEGF基因治疗闭塞性血管病是在全世界约600宗基因治疗临床试验中仅有的几宗疗效确切且副作用能够为病人耐受的成功案例之一，也是唯一的非病毒载体基因治疗成功的例子。
上世纪90年代以来，美国Tufts大学Elizabeth医学中心的Isner教授及其研究小组致力于VEGF基因治疗缺血性疾病的研究，并且首先获美国FDA批准进行VEGF基因治疗的临床试验。早期的工作主要针对外周动脉闭塞性疾病并取得了良好的疗效。1998年，他们首先在严重冠心病患者进行了微创心肌内注射phVEGF165质粒的临床试验。首次试验有5名志愿者参加，均为严重多支血管病变，已无法接受CABG术和PTCA术的冠心病患者，予phVEGF165质粒心肌内注射，术后1-3月，多数患者心绞痛发作减少，冠脉造影显示新的侧支血管形成。在以后的一系列研究中，近百名患者接受了该项治疗，通过多种评价手段对患者进行的随访观察证实基因治疗对于患者主观症状的缓解及客观上心肌灌注和心功能的改善确有促进作用，其中部分患者经1年的长期随访仍有满意的疗效。2002年，他们发表了第一项应用VEGF基因的随机双盲对照研究的结果。应用心电标测定位注射（NOGA）技术，19名患者分别接受心肌内注射phVEGF-2质粒或安慰剂，经过12周的随访，试验组心绞痛分级降低、运动时间延长，心肌灌注扫描结果改善，NOGA标测的心肌缺血面积减少，且各项指标均优于对照组。作为第一个成功的对照研究，这一结果对于VEGF基因治疗在冠心病的临床应用无疑具有非常重要的意义。
在国内，本研究所应用自行构建的pcD2/hVEGF121质粒进行VEGF基因治疗的研究。在大量动物实验的基础上，采用基因缝线作为基因导入途径治疗周围动脉闭塞疾病已获准进行临床试验。在冠心病研究方面，我们在大鼠、家兔和小型猪的心肌梗塞模型中予心肌内注射VEGF裸质粒，发现能够在缺血心肌中有效表达VEGF蛋白，并发挥促进心肌毛细血管增生和侧支循环建立的作用。合作单位在小型猪慢性心肌缺血模型中给予同样治疗也取得一定的疗效。
在VEGF基因治疗的研究中，病毒载体的应用相对较少。Rosengart等利用携带VEGF121基因的缺陷型腺病毒AdGVVEGF121进行冠心病治疗的研究，在动物实验成功的基础上，进行了I期临床试验。6名严重冠心病患者接受了单纯心肌内注射AdGVVEGF121的治疗。术后1月和6月时，6名患者心绞痛分级均有减低，5例患者应用硝酸甘油减少，没有发生严重不良反应。这一研究证实以腺病毒为载体进行VEGF基因治疗可以为患者所耐受，且有一定的疗效。国内盖鲁粤等的研究在猪慢性心肌缺血模型中应用Ad-VEGF165进行治疗，也证实疗效满意且安全性良好。在严密监控毒副作用的前提下，病毒载体的高效性仍然会受到重视。
基于近年来多个研究中心的工作成果，VEGF基因治疗已成为目前严重冠心病患者最具前景的新疗法，随着研究范围的扩展、内容的进一步深入，该疗法有希望在不远的将来在临床推广。
（2）FGF基因：在治疗性血管生成的研究中，对FGF应用的研究也较为广泛。在基因治疗方面，FGF-5基因首先被应用于心肌缺血治疗的研究。Giordano等在猪慢性心肌缺血模型中予冠脉内注射携带FGF-5基因的重组腺病毒，在心肌内成功地检测到FGF-5 mRNA和蛋白的表达；组织学检查发现FGF-5组心肌内毛细血管数多于对照组，缺血区心肌收缩功能改善更为明显。2001年，Grines等在美国进行了应用腺病毒载体的FGF-4基因治疗冠心病的随机双盲对照试验，入选了79名患者，结果显示，单次冠脉内注射Ad5-FGF4能够显著改善患者的运动时间，而不增加发生严重副作用的几率。
除应用分泌性的FGF亚型的基因以外，近年来，人们还尝试在非分泌性的FGF-1或FGF-2的基因中添加信号肽序列以加强其分泌能力，并将其应用于基因治疗。日本和美国的研究人员分别在FGF-1和FGF-2的基因中添加信号肽序列，构建入真核表达载体，导入髂动脉闭塞的家兔下肢肌肉中，发现添加引导序列的确能够促进蛋白的分泌，增强其促进侧支循环建立的能力，改善肢体缺血。这一方法有可能扩展FGF在冠心病基因治疗研究中的应用。
（3）HGF基因：日本学者Ogihara等应用HGF基因进行了部分缺血性疾病治疗的研究。应用HVJ-脂质体作为载体向大鼠梗塞心肌导入HGF基因，发现能够促进注射局部血管内皮细胞的增殖，增加心肌血管密度；对血管生成有重要作用的转录因子ETs的活化也进一步证实了HGF促进血管生成的作用。研究显示，心肌梗塞时，心肌内源性HGF的表达下调，外源性的HGF基因导入有可能通过提高HGF的水平而起到有益的作用。
（4）Angiopoietin-1基因：Angiopoietin-1基因治疗的应用目前还仅限于外周血管闭塞病的研究。肌肉注射angiopoietin-1的真核表达质粒能够促进髂动脉闭塞家兔缺血肢体骨骼肌内的毛细血管增生、促进侧支循环建立。
与VEGF不同，Ang-1促进血管生成的主要机制是促进血管支持细胞的聚集和血管的重塑，从而维持新生血管的完整性和稳定性，并防止炎症及血管通透性的增加，这使得它有可能发挥与VEGF互补的作用。VEGF又称血管通透因子，具有增加血管通透性的作用；实验表明，单纯VEGF作用下形成的新生血管通透性高，在治疗局部出现组织水肿是外源性VEGF治疗的副作用之一，而新生血管的不稳定性也可能影响到该方法的远期疗效。从功能研究的结果推论，在缺血性疾病中联合应用VEGF和Ang-1有可能克服VEGF增加血管通透性的不良作用，而且由于VEGF与Ang-1在血管形成过程中发挥作用的环节不同，二者的联合应用可能使新生血管获得持久稳定的结构，达到更理想的远期疗效。本研究所构建了Ang-1的真核表达质粒，通过局部肌肉电转基因，在大鼠下肢动脉闭塞模型上发现单独应用Ang-1基因可以促进局部新生血管和侧支循环的建立，防止血管闭塞所致的肌肉萎缩，而联合应用Ang-1及VEGF两种基因的治疗效果更加明显，并可减少单独转VEGF基因所导致的渗出。希望在进一步的研究中将这一方法推广到心肌缺血的治疗中。
尽管目前治疗性血管生成的基因疗法取得了很大进展，但我们仍应冷静地看到，尚有许多问题有待解决，如确定促血管生成治疗的最佳剂量和持续时间，基因的定位、定时表达（如仅在缺血部位、缺血发生时启动基因表达），联合基因治疗的必要性、可行性和最佳方案的确定等。
（三）血管成形术后再狭窄的防治
血管成形术后再狭窄是一直以来困扰介入医师的问题。目前认为，再狭窄的机制主要包括血管的弹性回缩、血管内膜增生和血管重构。其中血管的弹性回缩和重构主要发生在PTCA术后，血管内支架的使用能够大大减少这两种情况的发生；而内膜增生在PTCA术后和支架内再狭窄中都是重要的环节，如何抑制内膜增生也自然成为再狭窄防治研究的中心。从分子水平来看，血管成型术后内膜的异常增生与内皮细胞损伤、血小板粘附、局部炎症反应、细胞的增殖和迁移均有关，其中涉及多种生长因子和细胞因子的作用以及各种细胞周期调节蛋白的异常表达，因此再狭窄的防治也必然从这些环节入手。应用于再狭窄治疗研究的基因按照防治再狭窄的作用机制可以分为5类（表7-40-6）：①抗血栓形成：如TFPI基因；②促进损伤血管内皮化：如VEGF基因、HGF基因；③抑制细胞增殖：④如NOS基因、抑癌基因P53、细胞周期调节基因；⑤抑制细胞迁移：如TIMP(组织型金属蛋白酶抑制物)基因；⑥炎症抑制因子：如IL-10可能是一个有希望的选择。
表7-40-6 应用于防治血管成型术后再狭窄的基因
基因  生物学功能  防治再狭窄的作用机制  报道年份  参考文献
Pro-UK  抑制血小板粘附，溶解血栓  抗血栓形成  1999  中华心血管病杂志 27:349
TFPI  抑制组织因子（TF）功能   2001  Proc Natl Acad Sci USA 98:4078
VEGF  血管内皮细胞促分裂原  促进损伤血管内皮化  1996  Circulation 94:3291
    1998  中华医学杂志 78:749
HGF  血管内皮细胞促分裂原   2000  Gene Ther 7:1664
P21  抑制细胞周期依赖的激酶及PCNA  抑制 VSMC增殖  1995  J Clin Invest 96:2260
HSV tk  与更昔洛韦合用抑制细胞DNA合成   1995  Mol Med 1:172
Gax  血管损伤后VSMC中表达下调   1997  Cardiovasc Res 35:536
eNOS  增加NO及cGMP水平   1998  Circulation 98:919
iNOS  增加NO水平   1998  J Am Coll Surg 187:295
Rb  细胞周期抑制蛋白   1995  Science 267:518
Rb2/P130    1999  Circ Res 85:1032
P53  抑癌基因   1999  J Vasc Surg 29:360
激肽释放酶  生成激肽   1999  Hypertension 34:164
p27-p16融合基因  抑制细胞周期依赖的激酶   2001  Circ Res 89:323
TIMP-1  抑制基质金属蛋白酶（MMP）活性  抑制 VSMC迁移  1998  Hum Gene Ther 9:867
TIMP-2    1998  Gene Ther 5:1552
TIMP-3    2000  Circulation 101:296
ATF.BPTI  抑制纤维蛋白溶酶活性   2001  Gene Ther 8:534
CNP  增加cGMP水平  抑制血管重构  2000  J Am Coll Cardiol 35:1040
反义寡核苷酸及相关方法
As-c-myb  抑制细胞周期  抑制 VSMC增殖  1995  Circ Res 76:505
As-c-myc    1994  Circulation 90:944
    2001  Catheter Cardiovasc Interv 54:247
As-CDC2    1994  Gene 149:13
As-cyclin B1    1994  Gene 149:13
As-cyclin G1    1997  Circulation 96:628
As-bFGF  阻断bFGF的作用   1997  J Vasc Surg 25:320
AP-1特异的寡核苷酸诱媒  抑制细胞ppET-1的表达   2000  J Mol Med 78:441

与动脉粥样硬化相似，血管成形术后再狭窄也是一个有多因素共同作用的过程，尽管在动物实验中对多种靶基因的调节都显示了良好的治疗作用，但迄今为止尚无在人体应用的成功经验，单个靶基因的治疗在人体复杂的环境中能否奏效仍有待于研究的进一步深入。2001-2002年，雷帕霉素涂层支架预防再狭窄的临床试验取得了惊人的成功，一方面对于基因治疗的研究有一定程度的冲击，而另一方面也提示我们，寻找再狭窄发生发展过程中的关键基因仍将是基因治疗研究中的主要问题。由于血管内膜增生在支架内再狭窄的发生中发挥更主要的作用，因此针对内膜增殖的基因疗法有可能对支架内再狭窄的防治有较为显著的疗效。
三．心脏基因导入途径
基因转移途径的选择是心脏基因治疗的研究重点之一，也是其不同于其它疾病基因治疗的一个独特方面。心脏是人体最重要的器官之一，选择有效而安全的基因导入途径无疑是一个十分严肃的问题。
心脏基因转移的主要途径可以分为心肌内途径和血管内途径两大类，心包内基因转移也有少数报道。
（一）心肌内途径
心肌内途径在治疗性血管生成的研究中应用最多，其中开胸心肌内注射法导入基因制剂是常用的方式，这种方法能够实现基因的定位转移，且被证实能获得理想的效果。Isner等在临床试验中采取微创开胸心肌内注射的方法导入phVEGF165质粒，取得了满意的疗效。他们对30名接受微创心肌内注射的患者进行了专门的安全性观察[34]，结果显示，在完善的术前准备和术后监护条件下，严重冠心病患者能够良好地耐受微创开胸手术及其麻醉过程，心肌内注射未引起心肌组织的明显损伤，心肌特异的酶学指标未见异常，证实这一途径安全有效。
但开胸注射毕竟是一种创伤较大的方式，不易为患者接受。近年来出现的心电标测定位注射系统（NOGA），能够通过介入途径从心室腔内探测缺血心肌并实现经心内膜的心肌内注射。Kornowski等应用这种技术向猪的心内膜侧心肌注射报告基因，发现能够准确地将目的基因导入需要的部位并获得表达。近期Isner等进行的VEGF-2基因治疗冠心病的随机对照研究也采用了NOGA技术，获得了满意的疗效。与开胸注射相比，NOGA引导的经心内膜的心肌内注射创伤小、更为安全，其对缺血心肌的识别能力在临床应用中也提供了更多的便利，是一种很有前途的方法。
（二）血管内途径
血管内途径包括血管壁局部转移和冠状动脉内注射。在血管内介入治疗术后再狭窄的防治研究中经常采用血管壁局部给药的方式。本书第36章对这方面内容有详细介绍。
冠心病基因治疗研究中，冠脉内注射的方法仅在病毒载体有成功的报道。如前述携带FGF-5基因的重组腺病毒治疗动物心肌缺血获得成功，及Ad5-FGF4治疗冠心病的临床试验，证实冠脉内注射腺病毒载体的基因疗法可以获得理想的效果。但由于基因制剂可能经血液途径发生播散，仍然存在安全隐患，所以对这一方法的安全性仍需要进一步的确认。
四．问题与展望
冠心病的基因治疗经过过去10年的发展已经进入了临床应用阶段，但作为一种全新的治疗方法，仍然有很多问题有待进一步探索。目前研究的重点还将集中在几个方面：
1．  新的更适宜的治疗基因的选择；
2．  基因治疗载体的完善：理想的载体应具备良好的安全性，较高的基因转移效率，基因表达在时间和空间上的可控性；
3．  心脏基因转移途径的选择；
4．  对临床应用的安全性进行更全面的监控：这一点是基因治疗作为一种新的治疗方法在临床推广的前提。
虽然迄今为止的临床应用都显示了良好的疗效和安全性，但基因治疗的发展必定不是一帆风顺的，为将基因治疗真正推向冠心病治疗的前沿，我们的任务仍然十分艰巨。
第二节 冠心病的细胞治疗
一．概述
细胞治疗主要是指将具有分化潜能的自体或异体细胞移植入机体组织，在一定条件下使移植的细胞分化为所需类型的组织细胞，起到修复组织、恢复器官功能的作用。作为人体工程学的一个组成部分，细胞移植近年来逐渐受到重视，与器官移植相比，其实施更为简易，而采用移植细胞使器官功能获得一定程度的恢复也可能有效地缓解病情。
人体的多种组织器官都有不同程度的再生能力，在损伤后能够通过细胞的分裂增殖等活动得以修复，例如骨折的愈合、皮肤伤口的愈合、肝脏的再生等。相比之下，作为人体最重要的器官，心脏在损伤修复方面缺乏理想的机制。一般认为，心肌细胞是不能分裂的终末细胞，由于严重缺血而发生心肌坏死时，不能通过心肌细胞的增殖进行修复，而只能以纤维瘢痕的形式修复，因此会不同程度地影响心脏的收缩功能。在广泛心肌坏死导致心力衰竭的情况下，心脏移植是一种有效的治疗手段，但供体有限、技术复杂等因素限制了它的推广。细胞移植有可能作为一种替代手段发挥相当的治疗作用，成为近年来研究的热点。
细胞移植可以分为异体细胞移植和自体细胞移植两大类。在临床应用中，自体移植由于跨越了移植排斥和伦理两大问题而更具优势。
二．冠心病细胞治疗研究进展
目前，冠心病细胞治疗的研究仍处于初期，研究的重点集中在以下几个方面：①移植细胞种类的选择；② 确定移植细胞的存活、与宿主细胞的整合及功能的实现；③ 细胞移植治疗的安全性；④临床应用的可行性。本节将以不同移植细胞种类为线索对细胞治疗的进展作一简要介绍。
（一）胎儿心肌细胞
从理论上看，胎儿心肌细胞是心脏细胞移植的最佳选择，移植后能够替代坏死或损伤的心肌细胞，改善心功能。在动物实验中，移植的胎儿心肌细胞能够存活并与宿主心肌细胞间形成闰盘和缝隙连接，并与宿主细胞协调运动，增加心肌收缩力，改善心功能。但在实际应用中，由于胎儿心肌细胞对缺血、免疫排斥等损伤非常敏感，移植入缺血或梗塞的心肌组织中后不易长期存活，需要联合应用心肌保护药物；从临床应用的前景来看，人类的胎儿心肌细胞不易获得，体外培养十分困难，而伦理问题更是重要障碍。因此，目前胎儿心肌细胞的应用多限于探讨细胞治疗的可行性及机制研究等。
（二）胚胎干细胞
胚胎干细胞是心脏细胞移植的另一选择。人们已能够分离出多能性的人类胚胎干细胞，体外研究表明人类胚胎干细胞能分化成能够自主收缩、具有心肌结构和功能特性的细胞。在体动物实验显示，小鼠的胚胎干细胞能向心脏细胞分化，移植至缺血局部能够存活并形成稳定的移植组织，改善心功能，提高生存率。但将胚胎干细胞应用于心肌修复面临的问题仍很多，如如何控制在体细胞分化的过程、以保证获得具备正常生理功能的心肌细胞，如何避免细胞的异常分化如肿瘤的形成，在大动物的心脏疾病模型中能否成功应用，以及免疫排斥问题等。
（三）骨骼肌干细胞
骨骼肌干细胞即肌卫星细胞，是紧贴在骨骼肌细胞表面的一种扁平有突起的细胞，是储备的成肌细胞。骨骼肌细胞和心肌细胞都是横纹肌细胞，有相似的超微结构，都具有收缩功能，因此骨骼肌干细胞也成为心脏细胞移植研究的选择之一。
与心肌细胞不同，骨骼肌细胞是一种易疲劳的快收缩细胞，移植的骨骼肌干细胞只有分化成与心肌细胞类似的耐疲劳的慢收缩细胞才可能行使心肌细胞的功能。现有的研究结果显示，在多种动物的心肌梗塞模型中，骨骼肌干细胞能够成功地在病变区存活，并逐渐形成一种新的耐疲劳的慢收缩肌肉，从而改善心脏的收缩功能。移植细胞治疗作用的强度与移植的细胞数目成正比。在这里，移植细胞不表达心肌细胞特有的标志物MHC-α，说明移植细胞不是形成新的心肌细胞，而只是分化成能够负担心肌细胞功能的慢收缩细胞。骨骼肌干细胞的优势在于能够取自自身，因此不存在免疫排斥和伦理方面的问题，适于临床应用。但它仍然存在一些缺陷，如移植细胞不能与宿主心肌细胞形成细胞间连接，电活动不易协调；另外，尽管研究表明骨骼肌干细胞能够在体外获得一定程度的扩增，移植后仍可进一步增殖，但为得到足够数量的干细胞仍需切取较大体积的骨骼肌，对患者造成较大的创伤。
初步的临床试验显示，在进行冠脉搭桥术时，向梗塞瘢痕区注入自体骨骼肌干细胞能够改善心脏的收缩功能，缩小坏死区的面积；但尚无对照研究结果。
对骨骼肌干细胞进行基因干预，使其产生心肌特异性功能蛋白，也是目前研究的一个方面。
（四）骨髓细胞
目前认为，成体的骨髓中存在三种具有分化能力的细胞，即造血干细胞、骨髓间充质细胞（MSC）和内皮前体细胞（EPC）。其中，MSC是具有多向分化能力的原始骨髓细胞，在适宜的体内外环境中可分化为骨、软骨、脂肪、纤维结缔组织、骨髓基质等不同细胞；研究显示，小鼠的骨髓间充质细胞在体外用5-氮胞苷培养24小时，有分化成心肌细胞的潜能。EPC是从外周血中分离的一种细胞，来源于骨髓，能够定向地分化为血管内皮细胞，与胚胎发育过程中血管母细胞的作用相似。
近年来应用骨髓细胞进行心脏细胞治疗的研究非常活跃，细胞移植的策略不尽相同，主要的思路是心肌重建和血管重建。
Orlic等首先应用分离的骨髓细胞进行心肌梗塞修复的研究。他们采集雄性小鼠的骨髓，去除造血干细胞后注入同种雌性小鼠梗塞心肌的周边，发现移植细胞能够向坏死区迁移，分化成心肌细胞并进一步增殖，占据梗塞区面积达68%；移植细胞与宿主心肌细胞间能够形成细胞间连接并实现电机械耦联；移植细胞还可分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞，并整合入新生的血管；血液动力学参数的测定显示，细胞移植后9天，心脏收缩功能有显著的恢复。这种混合细胞移植的方法能够同时达到修复心肌与重建血管的目的。
Kocher等在裸鼠的心肌梗塞模型中应用采集的人EPC进行细胞治疗的观察。他们从接受G-CSF治疗的正常人骨髓中分离单核细胞，并进一步分离其中具有血管母细胞表型的EPC，通过静脉注射的途径导入裸鼠体内。研究显示，细胞移植后能够定居在缺血心肌，并促进局部新生血管形成，改善心室收缩功能，防止梗塞区的变薄、扩张，改善心室重塑的过程。这种细胞移植的策略着重于促进心肌的血管重建。
Fuchs等在猪的慢性心肌缺血模型中观察了自体骨髓细胞移植的作用，也着重从血管生成的角度对其治疗作用的机理进行了探讨。他们取动物的新鲜骨髓，经过简单滤过后注射入缺血心肌。4周后的观察发现，虽然缺血部位的微血管密度和侧支循环水平没有显著增加，但与对照组相比，心肌组织中内皮细胞的数量增多，缺血心肌的灌注和心脏收缩功能均有明显的改善。同时进行的体外实验显示，培养的骨髓细胞能够分泌VEGF和MCP-1，可能通过这2种因子对angiogenesis和arteriogenesis过程的促进作用而增加心肌灌注；另外，随着时间的推移，培养细胞中内皮样细胞的比例逐渐增加，这些骨髓细胞衍生的内皮细胞有可能整合入侧支血管对改善心肌灌注发挥一定作用。这项研究提出了应用未分离新鲜骨髓进行治疗的方法，简便易行，但如应用于临床，其安全性和有效性尚有待进一步验证。
与前述其它细胞类型相比，获取骨髓细胞的途径相对简单，对患者的创伤小，且能够实现自体细胞移植，因而避免了移植排斥和伦理方面的问题，在临床应用中有一定的优势。日本的Hamono等在5名冠心病患者进行自体骨髓单核细胞心肌内注射，随访发现其中3名患者的心肌灌注改善。2002年，德国的Strauer等报道了在心肌梗塞患者冠脉内注射自体骨髓细胞的研究结果。10例接受了急诊介入治疗的心肌梗塞患者，在心肌梗塞发病7天左右，在常规治疗的基础上接受了冠脉内注射自体骨髓单个核细胞。随访3个月的结果显示，细胞治疗能够有效减少心肌梗塞面积，改善心脏收缩功能和心肌灌注；与同期10名未接受细胞治疗的患者相比，上述的改善都更为明显。虽然这项研究不是严格的安慰剂对照试验，但其结果无疑也是令人鼓舞的。
（五）平滑肌细胞
平滑肌细胞是梭形无横纹的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。在内脏壁和血管壁的创伤愈合过程中，平滑肌细胞数目增加。平滑肌细胞被移植到大鼠心肌梗塞的瘢痕组织中，能够增加瘢痕组织的厚度，阻止心室壁变薄，使心脏功能得到改善。但由于平滑肌细胞不具收缩功能，因此不能从根本上解决心肌坏死后收缩功能下降的问题。
总结上述各种细胞的研究现状不难看出，目前在心脏细胞治疗中骨髓细胞和骨骼肌干细胞占有主要的地位，其原因主要是可进行自体细胞移植，跨越了移植排斥和伦理问题；可以较容易地获得较大量的移植细胞；且移植细胞易存活。随着临床研究的陆续开展，治疗时机的选择、剂量的确定、细胞导入途径等问题也将成为研究的重要方面。
三．基因/细胞联合治疗
基因治疗和细胞治疗在冠心病中应用的研究均是目前的热点，人们很容易会设想这两种新疗法的结合可能产生什么样的结果。与前述基因治疗的ex vivo途径不同，联合治疗中，细胞不仅作为外源基因的载体和表达场所，其本身也同时发挥治疗作用。
如前节所述，骨髓混合细胞的移植可能通过分化成心肌细胞修复梗塞组织和加速血管生成两种途径达到治疗目的，但未经分离处理的骨髓细胞移植存在细胞成分复杂、效应不稳定、剂量难以确定等问题。近期，Suzuki等用携带VEGF165基因的日本血凝素病毒载体转染大鼠的骨骼肌成肌细胞，并将这些细胞移植至同种系大鼠心肌梗塞模型的坏死心肌组织中，结果发现在心肌细胞再生的同时，心肌内VEGF表达增加，血管生成增加，心肌梗塞面积缩小，心功能改善，与单独移植未转染基因的骨骼肌成肌细胞相比有更显著的疗效。HVJ-VEGF对骨骼肌干细胞的转染效率可以达到95%以上，对基因转移的剂量可以进行较准确的控制，而应用骨骼肌干细胞进行心肌细胞移植也可以进行较精确的定量，所以与骨髓混合细胞移植相比，这种方法具有更理想的可控性。
2001年，美国的Isner研究组应用携带VEGF基因的腺病毒载体转染体外培养的分离的内皮前体细胞，发现经这种处理的细胞分裂能力增强，粘附并整合入内皮细胞单层中的能力也增加。将转染了VEGF基因的EPC注射入裸鼠的缺血肢体，能够促进新生血管形成，改善血流，减少肢体坏死。与单纯应用EPC移植相比，达到同样的治疗效果所需的EPC数量减少30倍。这项研究初步证实VEGF基因的参与能够增强细胞移植的疗效，在冠心病治疗方面也可借鉴。
四．问题与展望
冠心病的细胞治疗是很有希望的研究领域，如能安全有效地应用于临床，则能提高相当一部分患者的生活质量，提高生存率。美国NIH的心肺和血液协会组织专家对细胞移植在心脏中的应用进行了讨论，提出了一个短期目标和一个长期目标，可供借鉴。
（一）短期目标：
1．建立一套标准的评价方法，以对不同实验室及在不同动物上进行的细胞移植工作进行评价。评价内容包括：（1）移植细胞的存活；（2）移植成功细胞的分化状态；（3）移植细胞/宿主细胞间的电-机械偶联；（4）移植细胞是否对心功能产生了有益的影响。
2．确定转运移植细胞到心脏的最佳方法和时机；阐明移植细胞数量和随后的增殖情况与产生的移植组织大小间的关系。
（二）长期目标：
1．阐明移植细胞主动产生的改善心功能作用（如增加心肌收缩力）的大小和被动产生的改善心功能作用（如阻止梗塞面积扩展和心肌重塑）的大小。
2．阐明不同类型心脏疾病的细胞移植策略。
3．阐明不同来源的供体细胞移植的优缺点。
4．建立能增强移植细胞存活/活力的方法，阐明宿主心肌细胞损伤对移植细胞存活的影响。