miRNA 的生物合成过程

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来源：生物化学与生物物理进展
　　MicroRNA(miRNA)  是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码  RNA，它们主要参与基因转录后水平的调控。miRNA  的调控功能是十分重要的，近来发现它们在果蝇的细胞增殖、死亡及脂肪代谢，线虫极性的形成，哺乳动物的造血干细胞的分化等过程中起了重要的调控作用。在植物中，miRNA  还参与了叶子与花的发育过程。  

　　动物(尤其是人)  miRNA  的生物合成过程已经初步得到了诠释。首先，miRNA  基因的初级转录产物  (pri-miRNA)  在细胞核中被  RNase  Ⅲ  Drosha  切割成为前体  miRNA  (pre-miRNA)。在最初的剪切后，pre-miRNA  在转运蛋白  exportin-5  的作用下由核内转到胞质中，然后由另一种  RNase  Ⅲ  Dicer  进一步切割产生成熟的  miRNA。这些成熟的  miRNA  与其他蛋白质一起组成  RISC  (RNA-induced  silencing  complex)  复合体，从而引起靶  mRNA  的降解或者翻译抑制。这一过程如图1a所示。  

1  miRNA  基因的转录与转录初产物的剪接  

　　大多数  miRNA  基因与蛋白质基因距离比较远，它们可能有自己的启动子可以进行独立的转录。但是也有相当多的  miRNA  基因，人有1/4的  miRNA  基因是位于蛋白质基因的内含子当中的，通常  miRNA  基因与内含子的转录方向是一致的，这就说明这些基因大多是与寄主蛋白基因共转录的，然后再从这些蛋白质基因的内含子中剪切出来。并且同一类  miRNA  基因在不同生物体中的寄主基因往往是保守的同一类蛋白质基因。正是由于  miRNA  与其寄主蛋白基因是共表达的，而使它们的联系在进化过程中也保守地保存下来。还有一些  miRNA  基因是成簇分布在染色体上，它们通过一个共同的启动子转录成为多顺反子。虽然这种形式在线虫和人的  miRNA  基因中比较少见，但是果蝇的  miRNA  基因中一半是成簇的。而且这些成簇的  miRNA  基因经常是彼此相关的。例如人的  mir-15a-mir-16  基因簇是位于13号染色体上的一个抑癌基因中，而这一位置在  B  细胞与  T  细胞白血病中均产生了结构的畸变。经研究发现，这两个  miRNA  确实与白血病的发生有关。

　　目前，我们对  miRNA  基因如何转录成为  pri-miRNA  还知之甚少。研究发现  RNA  聚合酶Ⅱ和Ⅲ均可以参与  miRNA  的转录。位于蛋白质基因内含子中的  miRNA  基因毫无疑问是由聚合酶Ⅱ进行转录的。虽然大多数其他  miRNA  基因缺少加多聚腺苷酸尾的信号，还有一些间接的证据证明它们也有可能是聚合酶Ⅱ的转录产物：a．有些  pri-miRNAs  相当长，有时超过1  kb，这比聚合酶Ⅲ的转录产物长很多。b．大多数  pri-miRNAs  最后一个碱基为尿嘧啶，而这通常被认为是聚合酶Ⅲ提前中止的转录产物。c．许多  miRNA  基因的表达在发育过程中是变化的，这种表达变化通常在聚合酶Ⅱ的转录产物中比较常见。d．将某些  miRNA  基因的5'区域与报告基因的开放阅读框相融合，可以使报告基因得到表达，说明这种  miRNA  基因是可以通过聚合酶Ⅱ转录的。e．对于线虫  let-7  miRNA  的研究表明，let-7  pri-miRNA  有多聚腺苷酸尾，确实是由聚合酶Ⅱ的转录产生。另外，聚合酶Ⅲ也可以参与  miRNA  基因的转录。例如，给  miRNA  基因加上聚合酶Ⅲ的启动子由聚合酶Ⅲ进行表达，在体内不仅可以有效地表达出这些  miRNA，同时它们还可以行使其功能，这就说明，miRNA  的加工及其功能的行使与由何种聚合酶参与其基因的转录并没有必然的联系。

　　对于  pri-miRNA  转录后加工的研究十分有限，只有对线虫  let-7  miRNA  的研究比较完整。Bracht  等发现了两种长的5'端加帽，3'端加多聚腺苷酸尾的  let-7  pri-miRNA，是由聚合酶Ⅱ转录产生的。这些转录产物在5'端有剪接引导序列，它们可以作为反式剪接的底物。实验证明，初级转录产物的反式剪接对于成熟的  let-7  RNA  的产生十分重要，其序列和结构的变化对于接下来的剪切反应影响很大，含有成熟的  let-7  RNA  发夹结构前体，其附近序列的二级结构在剪接前后发生了变化，这一变化延长了  let-7  RNA  的发夹结构前体末端的茎区，这一结构也是  RNase  Ⅲ  Drosha  的底物类似物。同时，初级转录产物的反式剪接也去掉了对下一步剪切造成空间阻抑的序列。因此，对  miRNA  初级转录产物的剪接可以显著改变发夹结构前体周围的序列及结构，从而有利于对  miRNA  前体的进一步剪切。  

　　Pri-miRNA  的第一步剪切是由核糖核酸酶Ⅲ  Drosha  完成。其产物是～70  nt  的发夹结构前体  (pre-miRNA)。这一切割反应不仅切出了成熟的  miRNA  的3'末端，而且使3'末端有2  nt  的突出，这正是由核糖核酸酶Ⅲ进行切割的特征。而且，切割反应并不是发生在发夹结构前体的基部，而是基部上的几个碱基处。Drosha  进行切割的特异性序列还没有找到，但是前体基部的螺旋结构对于切割是十分重要的，因为在前体的茎区插入和删除序列将导致切割位点的改变。最新的研究发现，参与这一切割过程的是一个多蛋白质复合体，Drosha  是其中的重要成分，起到切割的作用。在这一复合体中，还存在一种双链  RNA  结合蛋白  Pasha  (partner  of  Drosha)。在果蝇细胞和线虫中抑制  Pasha  的表达，干扰了  pri-miRNA  的剪切，使细胞内  pri-miRNA  的积累增多，成熟  miRNA  的量减少。Pasha  在复合体中的具体功能还不清楚，但是它可能参与识别  miRNA  的初级转录产物，将它们集中到复合体中，有利于其被  Drosha  切割。另外，Pasha  可能对  pri-miRNA  在复合体中的定向有帮助，从而有利于  Drosha  在特定位点的切割。  

2  miRNA  前体的转运出核  

　　由于动物的  pre-miRNA  需要胞质中的  Dicer  酶进行进一步加工，转运出核就成为  miRNA  成熟过程中必需的一步。这一过程是通过依赖  RanGTP/exportin  5  的转运机制来完成的。在细胞核中，RanGTP  的浓度较高，Exportin  5  (Exp5)  就可以促进  pre-miRNA  从  Drosha  复合体中释放，并且与之结合，将其带到核外。由于胞质中  RanGTP  的浓度较低，Exp5  就释放  pre-miRNA，使之与  Dicer  结合进行下一步的切割。在运输过程中，miRNA  前体的3'突出将有利于其进入运出核的途径。  

3  Pre-miRNA  的剪切与  miRNA  的成熟  

　　在动物细胞核中，Drosha  的切割产生了成熟  miRNA  的一端(3'端)。另一端的切割成熟是由胞质中另一类核糖核酸酶Ⅲ  Dicer  切割产生的。Dicer  首先是在研究小干扰  RNA(siRNA)  引起的基因沉默中被发现的，后来发现它在  miRNA  的成熟过程中也起着重要的作用。Dicer  参与  miRNA  的成熟过程与  RNA  干扰中产生双链  RNA  的过程很相似：首先  Dicer  识别  pre-miRNA  的双链部分，其与茎环基部的5'端被磷酸化、3'端有突出的结构有很高的亲和力。然后，茎环基部的两圈螺旋解开，  Dicer  对两条链都进行切割，将前体的其余部分切掉，生成5'端磷酸化、3'端有2  nt  突出的类似于  siRNA  的不完全配对的双链。这条  RNA  双链是由成熟  miRNA  与  miRNA*  组成的(见图1a中的第4步)。miRNA*  是  pre-miRNA  上的一段  RNA，其位置恰好与成熟的  miRNA  相对。虽然  Dicer  在对  pre-miRNA  的加工过程中能够产生  RNA  双链中间体，但是这种中间体通常寿命比较短暂而不易被探测。不过，如果大量的前体均可产生并只产生一种  miRNA，则其双链中的星号链也可以成为成熟的  miRNA。  

　　就现有的动物  miRNA  成熟的模型来看，最初由  Drosha  介导的切割特异性决定了  miRNA  前体中  Dicer  的切割位点，从而决定了成熟  miRNA  的两端。由  Drosha  而不是  Dicer  决定这一特异性是由于研究表明  Drosha  对非特异性双链  RNA  的切割效率很差，而  Dicer  可以没有序列依赖性地切割任何  RNA  双链。并且  Drosha  的切割还依赖于  pri-miRNA  茎环基部的二级结构，以及茎环基部外侧125  nt  范围内的序列。

4  植物  miRNA  的成熟过程

　　植物  miRNA  的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有  Drosha  的同源类似物。在植物中通常很难检测到  pre-miRNA，即使在  DCL1  突变的植物中也很少检测到。DCL1  是植物  miRNA  成熟过程中类似于  Dicer  的蛋白质，它是位于核内的。这就说明在植物中可能有其他酶(很有可能是  DCL1  )行使了  Drosha  的功能，对  miRNA  的转录初产物进行第一次切割，并且决定了成熟的  miRNA  的序列。(如图1b中的第2步)。在  miRNA  离开细胞核之前，DCL1  (或其他酶)又进行了第二次切割，相当于动物细胞中  Dicer  对  pre-miRNA  的切割(如图1b中的第3步)。然后，可能是由  HASTY  (Exportin-5  在植物中的同源类似物)负责将  miRNA：miRNA*  双链转运出细胞核(图1b中的第4步)。由于经核内连续两次切割，在植物中才难以检测到  pre-miRNA  样的  RNA。  

　　拟南芥(Arabidopsis  thaliana)  作为植物中的一种模式生物，对其  miRNA  的研究是最多的。最近，对拟南芥  miR163  的研究进一步揭示了植物  miRNA  的成熟过程。拟南芥的基因组编码4种  Dicer  样的酶  (DCL1-DCL4)。其中  DCL1  是与  miRNA  的积累相关的，DCL2  和  DCL3  分别参与了由病毒引起的小干扰  RNA(siRNA)  和内源性  siRNA  (例如反转座子  siRNA)  的合成。拟南芥  miR163  是单独转录的，由  RNA  聚合酶Ⅱ催化合成，其转录初产物  pri-miR163  需要经过核糖核酸酶Ⅲ样的酶切割三次才能成为成熟的  miRNA。第一步是在  pri-miR163  的茎环结构的根部进行切割，得到长  miR163  前体  (pre-miR163)，第二步是对长  pre-miR163  中成熟的  miRNA  的3'根部进行剪切，得到短的  pre-miR163，最后是由短的前体切割出成熟的5'端成为成熟的  miRNA  (图2)。有趣的是，在整个剪切的过程中，四种小分子都可以被释放出来。进一步实验证明，拟南芥的  DCL1  至少可以对第一及第二步切割反应进行催化，即对  pri-  和  pre-miRNA  都可以切割。另外，第三步的切割反应可能也是  DCL1  催化的。所以拟南芥的  DCL1  蛋白参与了  miRNA  成熟的全过程。由于拟南芥的  DCL1  蛋白有两个类核定位信号，因此植物的  miRNA  的成熟是在细胞核中完成的。同时，研究表明，植物  DCL1  蛋白的双链  RNA  结合区在决定第一次和第二次的切割位点时是十分重要的。在  dcl1-9_dcl1-9  的突变体当中仍然有21  nt  的  RNA  片段产生，是因为虽然  dcl1-9  蛋白在随机位置上剪切  pri-miRNA163，但是却能准确量出第一次切割的位置到下一次切割的位置为21  nt。

5  展望  
　　MicroRNA  作为一种新近发现的小分子调控  RNA，其在生物体内起着十分重要的作用。关于  miRNA  各方面研究也在如火如荼地进行着。在  miRNA  的生物合成过程中，还有很多疑问没有被解决，例如，miRNA  基因在转录水平的调控，虽然有报道在线虫  miRNA  基因的上游  ～200  nt  的位置找到了一段保守序列  (CTCCGCCC)，但是在其他生物的  miRNA  中却没有找到这段序列。miRNA  作为一种调控因子，它本身的表达又由什么来决定呢？还有，动物当中  miRNA  末端的决定是由  Drosha  在对初级转录产物进行第一次切割的时候就决定了，而在植物中这一过程是由  DCL1  决定的，鉴于  Drosha  切割的特异性，因此成熟的动物  miRNA  可能要比植物中的  miRNA  更为保守，从序列上讲更加精确，这是否与多数动物  miRNA  与靶  mRNA  不完全配对抑制  mRNA  的翻译，而植物的  miRNA  通常与靶  mRNA  几乎为完美配对从而导致  mRNA  的降解有关呢？这些问题都有待于进一步地研究才能得到解决。对于  miRNA  成熟过程的研究，不仅可以使生物体的调控网络更加细化，还可以通过对这一过程进行人为的干预，从而进一步研究在不同物种中  miRNA  的功能及其起源等问题。
      注：

      （1）参考文献：略；需者可与本站Email联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；

      （2）文章来源：生物化学与生物物理进展，2005年  第32卷  第8期；

      （3）作者单位：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所  等。