定量RT-PCR

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定量 RT-PCR
    定量RT-PCR是将定量PCR与传统的反转录技术两者结合起来用于研究细胞基因表达情况一种研究方法。因此重点介绍一下定量PCR技术。
   自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术以来，因其展现了前所未有的敏感性和特异性，受到了人们的高度重视。随着该技术不断发展，有研究者们开始通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系，以达到对起始样品进行定量之目的。
   首先出现的是包括外对照定量法，内对照定量法，有限稀释定量法，竞争法等的传统定量PCR。这里简要介绍一下常用的内参照定量法。其原理是在含有待测靶序列的PCR反应管中同时加入已定量的内部标准，其不占据靶序列引物的结合位点，也不与靶序列存在同源性。待测的靶序列与内对照在扩增过程中使用不同的引物。在靶序列扩增的同时，内对照也被扩增。然后通过与内对照比较产物带的强度对待测靶序列进行定量。该方法要求内对照在样品中的起始量、扩增效率、电泳时的上样量都是标准化的，而且其必须与靶序列的起始量，指数扩增期的效率相似，才能较精确地对待测靶序列进行精确地定量。此外，对于定量RT-PCR，在采用内对照法时，可以选用一个内对照RNA与待测RNA一同进行反转录反应和扩增反应，以提高实验的可重复性。
   传统的定量PCR采用的是终点检测法，即在PCR反应到达平台期后进行检测。而由PCR反应的原理可知，当反应每个循环的产物均成为下个循环的底物时，产物的拷贝数以指数方式增长，产物量可通过公式Y=X（1+E）n（ Y代表产物量，X指起始模板核苷酸的量，n指反应循环数，E指扩增效率）来计算，但在进入了平台期后，PCR产物的积累不再依赖于投入的模板核苷酸量。加上，引物和扩增序列的特性、反应中组份的浓度以及反应温度等各种条件的不同，都会影响PCR反应的扩增效率。因此造成终点检测法的重复性差，定量不准确。加入内对照后，可部分消除对终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法仍只能算作粗略的定量方法。
与传统的定量PCR相比，1996年由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术采用的是即时检测，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，大大提高了定量PCR的重复性和准确性。下面就详细介绍一下荧光定量PCR。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
  实时荧光定量PCR按原理主要可分为两大类：
1)扩增序列非特异性检测法：
该方法的基础是采用DNA结合的荧光分子，如SYBR green Ⅰ等荧光染料。这里介绍一下SYBR greenⅠ荧光染料法：这是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当其与双链DNA结合时就能发出荧光，而从结合处释放出来时荧光信号急剧减弱,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料法的优势在于其能监测任何双链DNA序列的扩增，无需根据不同的实验设计特殊的探针，且灵敏度高。但正由于此方法未使用特异性的探针，实验的特异性完全由引物决定。若荧光染料与PCR反应中的一些非特异的双链DNA（如引物二聚体）结合，会产生假阳性的荧光信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
2)扩增序列特异性检测法：
   其关键技术是在常规PCR的基础上，加入了一种设计巧妙的荧光探针。该探针的设计方案有多种。其又可分为直接法和间接法。
   直接法是指通过荧光标记的探针与扩增产物结合后直接产生的荧光信号来进行PCR扩增反应的定量。如分子信标，其本质是一种荧光标记的茎－环发夹结构的探针，位于探针中部的是能与靶序列特异性互补的寡核苷酸序列，其构成发夹的环部。而其两端可有几个碱基存在互补关系，形成反转配对，形成发夹的茎部。而探针的5’端和3’端分别标记了一个荧光报告基团和一个淬灭基团。在游离状态下，当探针分子呈发夹结构时，两端的基团距离上接近，两者的能量传递效率几乎达100%,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，使信标分子不发出荧光。但在PCR反应的变性阶段，当靶基因双链打开形成单链时，分子信标即可与序列完全互补的靶序列形成异源双链杂交体，此时由于杂交体是相对刚性的，使发夹区被拉开，报告基团与淬灭基团彼此在空间上的距离增大，使报告基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。而在PCR反应的延伸阶段，分子又从模板上解离下来，重新形成了茎环结构，使荧光消失。因此随着每次扩增产物的增加，整个反应体系的荧光强度也增加。因此其可反映每次扩增末期扩增产物累积的量。但分子信标法可因探针不能与模板完全结合，稳定性差而影响实验结果，且探针合成时标记过程也较复杂。
   间接法采用的是水解探针的原理。常用的一种是TaqMan探针。即在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，其设计是其5’端和3’端也分别标记了一个荧光报告基团和一个淬灭基团，且能与模板发生特异性结合。当探针在自由状态且完整时，即两末端的基团相距较近时，根据荧光共振能量转移原理，探针在激发光下不发荧光。在PCR反应的退火期，探针与模板上引物包含区域内的序列发生特异性的杂交。而当合成链在延伸期达到探针结合处时，Taq酶发挥5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，将探针5′端连接的荧光报告基团切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。可见，在PCR过程中每增加一条产物，就多一个荧光分子信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。但该方法的不足之处是：由于该技术是利用Taq酶的5’外切酶活性，因此定量时受酶性能的影响较大。而且针对每种目标mRNA都必须设计并合成相应的探针。

  下面简要介绍一下荧光定量PCR的定量方法，先要提一下两个重要的概念：
1）荧光域值(threshold)：以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
2）Ct值：又称为循环域值，C代表Cycle，t代表threshold。其含义是：在PCR反应过程中，每个反应管内的荧光信号由本底到达设定的域值时所经历的循环数，可见Ct 值取决于域值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系（26）。起始拷贝数越多，Ct值越小。
实时荧光定量PCR的模板定量策略主要有两种：相对定量法与绝对定量法。
1)对于相对定量法来说，靶mRNA的表达量是相对于某个参照品而言的，其又分为标准曲线相对定量法与比较CT相对定量法。下面作简要地介绍：
标准曲线相对定量法：可在比较不同样品之间的RNA相对表达丰度时可采用。只需根据该参照品的相对稀释度即绘制出相应的标准曲线。待测品中靶序列的相对量来自于标准曲线，必须除以参照品的量得出。
在比较不同待测样品中mRNA的相对丰度时，必须使加入反应体系的RNA量标准化及消除逆转录反应造成的差异，因此需要在反应体系中加入一内源控制品。一般选用在不同组织或不同情况下表达较为恒定的一些管家基因或核糖体RNA作为内源控制品。
2)比较CT相对定量法：该方法与标准曲线相对定量法的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量。根据的是在PCR反应的指数期得到CT值来计算起始模板的量。此方法也需要一内源控制品，并以待测基因和内源控制品的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。
可见，在应用相对定量法时，需要考虑一下几点:采用何种相对定量法，选用合适的内源质控品，确定质控品与待测品的PCR扩增效率是否相似。
   而在绝对定量法中必须已知的标准品的量，即可得到待测样品的绝对量。常用质粒DNA或靶mRNA合成的cDNA常作为绝对定量的标准品。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。可见，在绝对定量法中标准品的定量准确与否是关键。