水稻突变体与功能基因组学

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突变体是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，水稻育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，γ 射线和 MNU 或 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此外，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐，全球建立了一系列的突变体库 (Sallaud et al.，2004；Kurata et al.，2005)。随着水稻全基因组测序工作的完成，水稻突变体已广泛应用于鉴定调控水稻形态和生理性状与基因的连锁分析及其相关基因的克隆和功能研究。本文就水稻突变体的创制方法、变异的机制、突变体/基因分类及数量、水稻重要基因的克隆等研究进展进行综述。

1 水稻突变体创制方法

1.1 自发突变

　　在自然环境下发生的遗传信息的变异或突变。但突变率低，一般少于0.1％。水稻的单蘖突变体 moc1 就属于自发突变。

1.2 物理、化学诱变

　　用物理、化学方法可快速获得较广的突变谱及稳定的遗传变异，可导致多位点的变异，比较容易得到饱和突变体库。且具随机突变优点。突变率可达3％左右。

　　应用辐射产生水稻突变体的电离辐射主要是 X 射线、γ 射线、紫外线、α 及 β 粒子、质子及中子等。一般水稻大部分以处理干种子为主，也可处理幼穗分化的植株。处理干种子时，辐射剂量一般在1.55×10-2～2.58×10-2 C•kg-1•min-1 左右，通常剂量不超过160伦/分。采用高剂量可以获得高的突变率，但大部分导致植株不育或畸形。物理辐射获得突变体约3万株，如水稻脆秆 bc1 突变体、无趋光性 cpt1 突变体和无冠状根 crl2 突变体 (Li et al.，2003b；Haga et al.，2005；Inukai et al.，2005)。

　　化学诱变剂的种类很多，可分为4类：(1)碱基类似物及有关的化合物，5-溴-尿嘧啶、5-溴去氧尿核苷、2-氨基-嘌呤和8-乙氧基咖啡碱；(2)抗生素，重氮丝氨酸、丝裂霉素 C 和链霉黑素；(3)烷化剂，甲基磺酸乙酯( EMS，ethy1 methanesulfonate )、N-甲基-N-亚硝基脲( MNU，methylnitrosourea )烯亚胺、亚硝基乙基尿烷和亚硝基乙基尿；(4)其他种类的诱变剂，亚硝酸和吖啶。

　　MNU 和 EMS 化学诱变处理种子最为普遍，诱变效应与化学诱变剂的浓度、温度、处理持续时间等有关。如 MNU 法和 EMS 法分别用0.015％～0.2％ MNU 和1.0％ EMS 在厌氧条件下浸11～18小时，水洗30分钟后，即可催芽。如水稻无冠状根 crl1 突变体 (Inukai et al.，2005)。

1.3 插入突变法

1.3.1 T-DNA 插入法 T-DNA 是来自根癌农杆菌 Ti 质粒，约20 kb，包含专化冠瘿碱生物合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。自 Hiei 等(1994)首次报道用农杆菌介导法对水稻成功地实现遗传转化以来，该方法在水稻遗传转化中得到广泛应用并不断完善，并被广泛应用于水稻 T-DNA 插入突变体库的构建。一旦获得 T-DNA 突变，便可以 T-DNA 作标签直接分离基因 (Walden et al.，1991)，如水稻 OsCP1 基因的克隆。T-DNA 在基因组中随机插入后位置比较固定，然而，T-DNA 插入对特定的基因类别没有明显的偏向性 (Alonso et al.，2003)。

1.3.2 转座子法 转座子( transposon )是染色体上一段可移动的 DNA 片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。用转座子引起的突变的转座子 DNA 为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的 DNA 片段，并获得含有部分突变株 DNA 序列的克隆，进而以该 DNA 为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。

　　根据转座子的增殖方式，可分转座子和逆转座子两类，相应地可利用转座子插入法( Ac/Ds 系统插入) 和逆转座子插入法 (逆转录转座子 Tos17) 建立水稻突变体库。

　　Ac/Ds 系统：Ac/Ds 系统是玉米中的一个转座子家族。Ac 因子单独存在便可引起转座突变，但变异不稳定，Ds 因子在有 Ac 因子或合成转座酶的序列存在的条件下，才会引起插入突变。Ac/Ds 因子以非复制的方式转座即所谓“切粘”机制；但也会在染色单体间发生基因转换，使转座子拷贝数增多，如水稻花粉育性相关的 aid1 突变体 (Zhu et al.，2004)。

　　逆转录转座子 Tos17：逆转录转座子的增殖和转座子均以 RNA 为中介，通过 DNA-RNA-DNA 的方式进行，涉及逆转录过程，因而被称为逆转录转座子( retrotransposon )。逆转录转座子的主要特征是两端具有长的同向末端重复序列( long terminal repeat，LTR )。LTR 主要携带有转录起始和终止信号及转座所需的调控序列，在正常条件下它们是失活的。由于逆转录转座子通常只引起稳定的突变，因此用常规的遗传分析方法，很难区分逆转录转座子引发的突变和其他因素引起的变异。尽管水稻逆转录转座子拷贝数较多，研究难度较大，但日本学者 Hirochika 等(1996)建立了水稻逆转座子 Tos17 突变体库，Sato 等(1999)利用这些逆转座子 Tos17 基因敲除体系分离了 OsH15 等水稻基因。

2 突变的机制

　　突变的本质就是 DNA 序列的改变，包括单个碱基或大的片段发生突变、插入、缺失或结构重排，从而导致遗传信息的改变。突变的机制主要有以下几种。

2.1 直接作用于 DNA 模板

　　亚硝酸和烷化剂等化学诱变剂可直接作用于 DNA，改变模板的性质或干扰复制，使错误的碱基插入而产生突变。如最常用的 EMS 化学诱变所导致的 DNA 突变。

2.2 碱基类似物诱变

　　DNA 复制时渗透入并且与互补链上的碱基生成氢键而配对，从而抵抗 DNA 酶的3'-5'外切核酸酶活性的校对功能。如5-溴-尿嘧啶、5-溴去氧尿核苷、2-氨基-嘌呤、8-乙氧基咖啡碱所导致的 DNA 突变。

2.3 移码突变

　　吖啶橙、原黄素和吖黄素等吖啶类染料分子均含有吖啶稠环。这种三环分子的大小与 DNA 的碱基对大小差不多，可以嵌合到 DNA 的碱基对之间，于是原来相邻的两个碱基对分开一定的距离，含有这种染料分子的 DNA 在复制时，由于某种目前尚不知晓的原因，可以插入一个碱基，偶尔也有两个。这样就出现一个或几个碱基对的插入突变。有时也有很低频率的单碱基缺失突变。所有这些突变，都引起阅读框的改变。

2.4 转座成分的致突变作用

　　生物体内含有许多转座成分，它们一般长数百至数千 bp，可以通过一种复杂的转座机制将其一个复制拷贝插入到基因组的另一个位点。如果这个位点处于一个基因内部，这种大片段的插入常常造成基因失活。

2.5 紫外线等的致突变作用

　　紫外线照射 DNA，由于高能粒子的直接作用和自由基的间接作用，引起 DNA 分子的各种损伤，嘧啶二聚体是其中一种重要的损伤。这些损伤诱发了错误潜伏的 SOS 修复系统，从而导致很高的突变率。

3 水稻突变体和基因分类及数量

　　自20世纪70年代以来，理化诱变法及插入突变法的应用，大大地加快了突变体的创制步伐，从而建立了一系列的突变体库。至2004年，韩国构建了由3万个水稻 T-DNA 插入突变体群体，法国构建了由6000多个水稻 T-DNA 插入突变体群体 (Sallaud et al.，2004)，日本 Shimamoto 实验室利用 Ac/Ds 转座子标签已创造6000多个水稻突变体，Hirochiko 实验室应用逆转座子Tos-17 也构建了突变体群体，还有澳大利亚、荷兰和美国等不同国家的科学家也正致力于水稻插入突变体库的构建(朱克明 等，2006)。我国的 T-DNA 插入突变群体5万个株系以上；物理辐射突变体约3万株；EMS 化学诱变突变体约2万株(图1)。加之，全球有12万余份稻种资源，我国有8万余份。这些丰富的突变或变异材料，为大规模发掘和分析基因的结构和功能提供了必要的条件。

　　水稻突变体分类参照 Kurata 等(2005)的方法，分成营养器官、生殖器官、异时性、颜色、种子、抗性以及数量性状 (QTLs) 7大类，22个亚类(表1)。在1698个分类的水稻突变体和基因中，营养器官、生殖器官、异时性、颜色、种子、抗性以及数量性状的突变体/基因数分别占16.25％、27.32％、0.23％、7.83％、13.89％、16.96％和17.49％。

4 水稻重要基因的克隆

　　产生的突变体已用于鉴定调控水稻形态和生理性状与基因的连锁分析以及基因的定位与克隆。1998年，国际水稻遗传协会报告了571个定位的突变体基因。2005年6月，Gramene 网站报道了1488个水稻突变体，Oryzabase 网站公布了约1698个水稻突变体和基因(含数量性状基因)，中国水稻研究所开设的国家水稻数据中心 (China Integrated Rice Data Center，CIRDC) 网站 (http://www.ricedata.cn) 也开始陆续公布“水稻突变体表型-基因克隆-分子育种”的相关数据。虽然全球已分离了3万条水稻 cDNAs 和40万条 ESTs，但大部分特殊性状基因尚未分离，许多水稻突变体材料尚未分类。随着水稻全基因组测序的完成和克隆技术的迅速发展，人们对有益基因定位、克隆、转移和累加越来越关注。自1995年应用图位克隆技术在水稻中成功分离 Xa21 基因以来，已克隆了约43个水稻突变体基因(表2)，其中包括我国克隆的 MOC1、BC1 和 ALK 等基因。

4.1 水稻白叶枯病抗性基因 Xa21

　　1992年，美国康奈尔大学和国际水稻研究所联合，Ronald 等以供体亲本非洲野生稻品种 Oryza longistaminata 与受体亲本 IR24 构建而成的含有 Xa21 基因的近等基因系为材料，将 Xa21 基因定位于第11染色体上。1995年，中国科学院遗传研究所与美国加州大学戴维斯分校的科学家合作，成功地采用图位克隆方法获得了水稻的白叶枯病抗性基因 Xa21。Xa21 是一个兼具亮氨酸富集重复序列 (LRR) 和丝氨酸苏氨酸激酶 (STK) 的植物抗性基因 (Song et al.，1995)。 Xa21 的 LRR 受体结构域与 CF-9 的同源性暗示它也是—个胞外受体，可能直接与产生的多肽相互作用。Xa21 的 STK 区域与番茄 Pto 产物同源，可能具有相似的作用。在动物细胞中，配体与受体酪氨酸激酶的胞外结构结合诱导受体的同型二聚反应，自动激发磷酸化反应。Xa21 作为一个受体类似的激酶在病原菌识别和信号转导中的作用机制可能相似。

4.2 水稻分蘖控制基因 MOC1

　　分蘖是影响单产的重要农艺性状之一，是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性，对超高产育种和“量化理想株型”的构建具有重要意义。我们在粳稻品种 H89025 中发现的天然 moc1 突变体，完全丧失了分蘖能力，只有一个主茎秆。受单个核基因的隐性基因控制，MOC1 位于第6染色体上。 moc1 突变体在 ORF1 编码区内插入了一个1.9 kb 的逆转座子序列，转录中断而造成蛋白质的翻译提前终止。MOC1 编码 GRAS 家族的转录因子，决定腋生分生组织起始和生长。水稻幼苗基部不伸长节间的解剖研究表明，野生型水稻有分蘖芽的形成，而 moc1 突变体则没有，说明单秆表型是由于分蘖芽形成的缺陷造成的 (Li et al.，2003a)。

4.3 水稻脆秆控制基因 BC1

　　水稻脆秆籼稻 bc1 突变体，由中国水稻研究所从辐射中获得，表现脆嫩，易折断，比野生型有较少的纤维素和较多的木质素，单糖含量也受影响。bc1 突变体的茎、叶脆嫩性状受单隐性基因控制，BC1 位于第3染色体上。序列分析表明，在 bc1-1 突变体中，发现一个单碱基 (T) 插入在第425密码子中 (TTC→TTTC)，产生 a+1 的移码突变。bc1-101 等位基因突变是由于第一个外显子236和237密码子处有4个碱基的缺失(AGGTGC→AC)。这个缺失引起了移码突变，从而导致在292密码子处产生终止密码子。BC1 调控细胞壁的加厚和植株的机械强度，编码一个类 COBRA 蛋白基因。RNA 原位杂交的结果表明 BC1 基因主要在维管束和厚壁组织表达。bc1 突变体的发掘和克隆不仅剖析了细胞壁的形成和植株机械强度的分子机理，而且还可能有利于选育谷草兼用型水稻品种 (Li et al.，2003b)。

4.4 水稻半矮秆基因SD1

　　水稻株高是一个与高产育种密切相关的重要农艺性状。目前，矮秆突变体已注册到 d-61 和 sd-8。在所有已知的株高突变体中，绝大多数与 GA (gibberellin) 和 BR (brassinosteroid) 激素有关，特别是与 GA 合成有关。如 D35、SD1 和 D18 基因编码 GA 生物合成、D1、GID2、 pkl 和 SLR1 参与 GA 信号转导。OsBR6ox、D2、D11 和 BRD1 编码 BR 生物合成、D61 和 Osbril 基因参与 BR 信号转导。2002年， Sasaki 等克隆了 SD1 基因，第一次绿色革命基因。SD1 等位基因含383个碱基缺失，引起了移码突变，而产生终止密码子。SD1 编码 GA20 氧化酶(分3步从 GA53→A44→A19→A20)。GA20ox-2 基因在叶片和茎中表达，产生较短的叶片和较矮的植株。

4.5 水稻抽穗期基因 Hd1

　　Hd1 是第一个克隆的水稻数量性状基因。利用图位克隆方法对重要的数量性状基因进行克隆，实质上就是对多个数量性状基因中起主效作用的1个或几个进行精细定位，然后采取与质量性状一样的克隆方法。Yano 等(2000)利用日本晴和 Kasalath 衍生的群体，共检测到15个 QTL；再通过构建近等基因系，图位克隆了 Hd1、Hd6、Hd3a 和 Ehd1 系列基因4个。Hd1 含2个外显子，编码一个395个氨基酸的蛋白，是拟南芥带有锌指结构域的 CO 家族中的一员。Hd1 在日本晴与 Kasalath 等位基因之间有许多结构上的不同，Kasalath 等位基因第2个外显子有一个2 bp 的缺失，产生一个提前的终止子，Kasalath 的 Hd1 蛋白就缺少了 C 末段区域而短于日本晴蛋白。Hd1 可能具有双重功能，在短日照促进抽穗和在长日照抑制抽穗。由于锌指结构的存在，Hd1 会与转录活性有关，但由于 Hd1 本身的转录并不受日照长短的影响，推测转录受它影响的基因的表达受光周期变化的控制。

4.6 水稻糊化温度控制基因 ALK

　　糊化温度是仅次于直链淀粉含量的评价水稻稻米蒸煮品质的重要指标。许多文献报道，该性状受一主效基因控制，因此对水稻糊化温度基因的克隆，有助于水稻品质的分子改良。中国水稻研究所的科研人员采用图位克隆法已成功分离到水稻糊化温度基因 ALK，序列分析表明其编码可溶性淀粉合酶Ⅱ。进一步比较不同品种间该基因的 DNA 序列以及碱消法分析结果，推测出 ALK 基因编码区内的碱基替换可能引起了支链淀粉晶体层结构的改变，从而导致糊化温度的变化。基因克隆得到了功能互补实验的证实，从而为淀粉合成基因的表达调控提供了理想的材料，为淀粉合成代谢机理的阐明打下了基础(高振宇 等，2003)。

5 展望

　　水稻全基因组测序完成将大大促进水稻重要性状基因的分离和特征化。创制和建立水稻饱和突变体库并建立突变体研究体系，进而定位和克隆不同发育和生理途径的基因及获取高产、优质、多抗、高效和环境友好型新品种(系)将是下一步的研究重点。

　　(1) 创制和建立水稻饱和突变体库

　　利用突变体库研究5万个水稻基因的功能就要建立饱和突变体库。按照 Krysan 等(1999)建立饱和插入突变体库的公式 P=1-(1-f)n，要获得 P 为99％的概率，平均基因大小为4 kb 推算，则需要 n 为约50万个突变体库的容量，但从目前的报道来看还相差很大。然而，从拟南芥插入突变体库的构建及其研究所取得的进展，可以预见随着水稻饱和突变体库的建立，会有更多的水稻基因被克隆鉴定，特别是控制重要农艺性状的基因，这将会对农业生产产生巨大影响。

　　(2) 建立突变体研究体系

　　收集和定位不同发育和生理途径的基因将有利于揭示这些基因的网络效应。由于植株的生长反应和形态突变体对研究水稻发育起着重要作用，单个基因的特征化不足于完成这类研究。只有用基因组和生物信息学等系统工作，建立一个所有基因敲除的突变体研究体系、突变体和变异材料的芯片分析及一个生物信息学处理大量数据的理想的分析系统，才能共同促进功能基因组学研究。

　　(3) 重要基因的克隆

　　超高产相关基因和抗逆基因的克隆是研究的重点，特别是与少蘖、大穗、粒重、高产及高光效等超高产相关的突变体或基因；发掘和克隆水稻植株化感作用、氮/磷肥高效利用等种质和基因，以期减少除草剂、农药和化肥等化学制剂的使用，保护生态环境，实现农业可持续发展；环境钝感的优质突变体/基因以及特优米基因和第三代功能米基因的鉴定和克隆。

　　(4) 为分子育种提供物质基础

　　传统水稻育种的成功主要依赖于一系列优异基因(矮秆基因、抗病和细胞核雄性不育基因)的发掘和利用，突变体的发掘和功能基因组发现的新基因也将大大促进水稻新品种的选育，特别是品种之间的序列与表型差异将为分子育种提供一个前所未有的机会。3～4万个水稻基因的功能注释完成以后，对植物界有普遍意义。目前，已利用遗传工程将单个或多个目的基因导入水稻栽培品种，改良作物某些性状。随着分子育种技术的发展，人们将利用已克隆的水稻基因，结合高效转化、分子标记辅助选择与常规育种技术，建立分子设计育种的技术平台，选育出高产、优质、多抗、高效和环境友好型新品种(系)。