毒力岛

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近年来,随着分子生物学研究的不断深入,在细菌学领域出现了一些新的概念,毒力岛(pathogenicity island)为其中之一。毒力岛是指编码细菌毒力基因簇的分子质量比较大的染色体DNA 片段,其特点是两侧一般具有重复序列和插入元件,通常位于细菌染色体tRNA 位点内或其附近,不稳定,含有潜在的可移动元件,其基因产物多为分泌性蛋白或表面蛋白.
毒力岛的G+ C 含量与宿主菌染色体的G + C 含量有明显差异,说明它并不是先天就有的,而可能是在进化过程中获得的。目前,已知许多病原性细菌,如大肠埃希氏菌、沙门菌、李氏杆菌、耶尔森氏菌 、幽门螺杆菌 、霍乱弧菌、金色葡萄球菌等,都存在毒力岛,而且一种病原性细菌往往具有1 个或多个毒力岛。细菌毒力岛的发现,使人们对细菌致病性的认识发生了很大变化。以往人们往往认为细菌的毒力是单因素的,或者其中的某一个毒力因子发挥着决定性的作用,现在则认识到细菌毒力的产生比原来想象的要复杂得多。
因此,细菌毒力岛的发现,对从基因水平上了解细菌性疾病的发病机理具有重要意义。使人们对病原菌的进化方式有了新的认识。认识到只需一个单一的遗传重组步骤就可能使一个非病原菌变成病原菌,也认识到细菌毒力是一个多基因作用的复杂过程,为研究新出现的病原菌和重新抬头的病原菌提供了新思路。

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幽门螺杆菌毒力岛及其主要功能
幽门螺杆菌(Hp)含有多种毒力岛（PAI），Hp-PAI是细菌在人胃中定居和生存所需要的。Hp-PAI有多种，其中有两种特别重要：尿素酶和鞭毛。尿素酶的作用是在酸性pH中水解尿素，产生CO2和氨，形成中性的小生境，保护了Hp免受胃酸的损害。鞭毛使细菌游动穿过胃粘膜，在黏膜下形成比较中性pH，细菌一旦达到黏膜下就牢固的黏附到下面的细胞中。Hp黏附素是一种蛋白质（BabA）,能结合到胃上皮细胞的Lewis b 血型抗原上，Lewis血型抗原与Hp的其它一些致病作用有关。Hp某些菌株的脂多糖（LPS）在胃黏膜上的表达，类似Lewis x和y血型抗原的结构。这种抗原模仿作用可导致抗病原菌抗原的免疫耐受或识别胃上皮细胞的自身抗体感应，这种现象常常在慢性活动性胃炎病人中观察到[5]。Hp LPS的低内毒素和生物学活性不同于其他细菌，主要是缺乏脂结合4’－磷酸盐，而存在14碳脂质A。近年来，发现幽门螺杆菌黏附素(Leb)-binding adhesin BabA，黏附在上皮细胞膜上，保护细菌免受胃腔的酸性。这种细菌黏附素(Leb)-binding的生物表型与临床分离的Hp VacA（vacuolating cytotoxin A, 空泡细胞毒素A） 和cagPAI (cytotoxin- associated gene ，细胞毒素相关基因毒力岛)有关，对于Hp致病性起重要作用,可引起严重的胃十二指肠病，如消化性溃疡和胃癌。Hp直接作用于周围组织分子中最重要的是中性粒细胞活性蛋白（neutrophil activating protein , NAP），这种蛋白能够激活中性粒细胞，并可使这些细胞集中到胃黏膜，而出现炎症反应。Hp诱导多形核白细胞（PMNL）渗透到胃黏膜，引起急慢性胃炎的机理，目前了解的并不多。实验表明使用Hp肉汤培养滤液（BCFs）和不同菌株的细菌上清液加入生长在有浸透性的滤器上汇合成片的极化单层细胞（人肠内细胞株T84）中，通过T84上皮细胞对PMNL的反应，评价Hp Vac和cag PAI对PMNL移动的影响。T84细胞与cag PAI+ 和cagE PAI+ Hp菌株培养后，促使PMNL穿过上皮细胞移动，VacA对PMNL穿过上皮细胞移动无明显影响。
Hp-Vac-PAI：VacA是一种分泌型蛋白毒素，在感染宿主中观察到对胃上皮细胞的损害作用，引起靶细胞空泡样变性，阻碍细胞内膜融合。空泡象是一种溶酶体和后期核内体区室之间的杂合体。空泡的产生要求空泡3-磷酸腺苷依赖质子泵和少量3-磷酸鸟苷结合蛋白Rab7。VacA是一种寡聚毒素（oligomeric toxin），具有6个或7个半径对称的花瓣样结构。寡聚毒素是无活性的，必须在低pH处理后分裂成90-kD的单体才能显示活性。VacA的细胞结合部位在300-氨基酸区域含有2个等位基因（m1 和 m2），具有不同的靶细胞特性。用标准空泡形成测定法认为m1是HeLa细胞毒。然而，m1 和 m2两者在原胃细胞中是有活性的。为什么这种功能的多形性并不清楚。因为m1在西方、韩国、日本人的分离物中占优势，而m2在中国人中分离物中占75%。
Hp-cag-PAI：是一个免疫优势抗原编码的基因，只存在与胃十二指肠疾病有关的Hp菌株中（1型菌株），该基因位点包含cagA（cag），在40-kb DNA插入部位，很可能是水平获得和完整的染色体谷氨酸消旋酶基因。PAI旁侧直接被31bp重复。在HP 某些菌株中，cag 被一个新的插入序列（IS105）分裂成右侧片段cagI和左侧片段cagII。某些Hp菌株的cagI和 cagII分别插入染色体序列中。在少数HP菌株中cagI区核苷序列为23508 bp，cagII区3’端存在一个19 ORFs的蛋白质编码，预知绝大部分隔膜与cagE基因有关。cagE基因类似百日咳杆菌的毒素分泌基因ptlC, 传递系统要求质粒传递，包括根瘤土壤菌virB4基因。个别cag I基因转座子灭活，消除了在胃上皮细胞表达的IL-8 的感应。因此，人们相信在cag 区可编码一个新的Hp分泌系统用作毒素的测定。
Hp-cagA是多数临床分离株所产生的一种亲水性蛋白和128 KDa表面暴露蛋白。cagA cagA是cagA–PAI部分的免疫耐受抗原，基因大小及其蛋白质在不同菌株中是不同的。核苷酸序列和免疫耐受抗原的表面表达以及疾病时对抗原的免疫应答与胃炎、消化性溃疡、胃腺癌的发病有关。ELISA法测定抗该蛋白重组片段的免疫反应，胃十二指肠病人为75.3%，十二指肠病人为100%。人们认为只有携带这种蛋白的细菌才与疾病有关。基因分析指出cagA只存在I型菌株中，而vacA则存在I和II两个型中，活性毒素只有I型菌株产生。然而cagA和vacA表达之间的连接并不清楚，由于cagA和vacA基因位点在Hp菌株的染色体部位分开，大于300kb。此外，cagA基因灭活时对vacA表达与引导IL-8产生的能力没有因果关系。这些发现认为cagA是I型菌株毒力增加的标纪。为进一步了解I型和II型菌株之间的关系并剖析Hp的某些毒性，分析了cagA基因侧面区域。发现I型菌株含有约40 kbDNA（cag区）片段的插座子，具有典型的PAI特性。这个PAI编码是增加Hp菌株毒性唯一的毒力因子，并认为该区域的获得是Hp演变的重要结果。

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幽门螺杆毒力岛及其病原性研究进展
朱庆义

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）于1982年首次在人胃活检组织中分离，是一种革兰阴性微需氧菌，与胃炎、消化性溃疡和胃癌的发病密切相关[1]。毒力岛或称致病岛（pathogenicity island, PAI）是近年来在细菌学领域中出现的一个新名词，与细菌的致病性密切相关[2]。幽门螺杆菌毒力岛(Hp-PAI)是由Ⅳ型分泌系统编码基因水平转移获得的，是细菌毒性的主要决定因素[1]。本文对Hp-PAI及其致病性研究进展，综述如下。

一、 幽门螺杆菌毒力岛及其主要功能
幽门螺杆菌(Hp)含有多种毒力岛（PAI），Hp-PAI是细菌在人胃中定居和生存所需要的。表1所示， Hp-PAI有多种，其中有两种特别重要：尿素酶和鞭毛。尿素酶的作用是在酸性pH中水解尿素，产生CO2和氨，形成中性的小生境，保护了Hp免受胃酸的损害[3，4]。鞭毛使细菌游动穿过胃粘膜，在黏膜下形成比较中性pH，细菌一旦达到黏膜下就牢固的黏附到下面的细胞中。Hp黏附素是一种蛋白质（BabA）,能结合到胃上皮细胞的Lewis b 血型抗原上，Lewis血型抗原与Hp的其它一些致病作用有关。Hp某些菌株的脂多糖（LPS）在胃黏膜上的表达，类似Lewis x和y血型抗原的结构。这种抗原模仿作用可导致抗病原菌抗原的免疫耐受或识别胃上皮细胞的自身抗体感应，这种现象常常在慢性活动性胃炎病人中观察到[5]。Hp LPS的低内毒素和生物学活性不同于其他细菌，主要是缺乏脂结合4’－磷酸盐，而存在14碳脂质A[6]。近年来，发现幽门螺杆菌黏附素(Leb)-binding adhesin BabA，黏附在上皮细胞膜上，保护细菌免受胃腔的酸性。这种细菌黏附素(Leb)-binding的生物表型与临床分离的Hp VacA（vacuolating cytotoxin A, 空泡细胞毒素A） 和cagPAI (cytotoxin- associated gene ，细胞毒素相关基因毒力岛)有关[7]，对于Hp致病性起重要作用,可引起严重的胃十二指肠病，如消化性溃疡和胃癌[8，9]。Hp直接作用于周围组织分子中最重要的是中性粒细胞活性蛋白（neutrophil activating protein , NAP），这种蛋白能够激活中性粒细胞，并可使这些细胞集中到胃黏膜，而出现炎症反应。Hp诱导多形核白细胞（PMNL）渗透到胃黏膜，引起急慢性胃炎的机理，目前了解的并不多。实验表明使用Hp肉汤培养滤液（BCFs）和不同菌株的细菌上清液加入生长在有浸透性的滤器上汇合成片的极化单层细胞（人肠内细胞株T84）中，通过T84上皮细胞对PMNL的反应，评价Hp Vac和cag PAI对PMNL移动的影响。T84细胞与cag PAI+ 和cagE PAI+ Hp菌株培养后，促使PMNL穿过上皮细胞移动，VacA对PMNL穿过上皮细胞移动无明显影响[10]。
Hp-Vac-PAI：VacA是一种分泌型蛋白毒素，在感染宿主中观察到对胃上皮细胞的损害作用，引起靶细胞空泡样变性，阻碍细胞内膜融合。空泡象是一种溶酶体和后期核内体区室之间的杂合体。空泡的产生要求空泡3-磷酸腺苷依赖质子泵和少量3-磷酸鸟苷结合蛋白Rab7。VacA是一种寡聚毒素（oligomeric toxin），具有6个或7个半径对称的花瓣样结构。寡聚毒素是无活性的，必须在低pH处理后分裂成90-kD的单体才能显示活性。VacA的细胞结合部位在300-氨基酸区域含有2个等位基因（m1 和 m2），具有不同的靶细胞特性。用标准空泡形成测定法认为m1是HeLa细胞毒。然而，m1 和 m2两者在原胃细胞中是有活性的。为什么这种功能的多形性并不清楚。因为m1在西方、韩国、日本人的分离物中占优势，而m2在中国人中分离物中占75%[11，12]。
Hp-cag-PAI：是一个免疫优势抗原编码的基因，只存在与胃十二指肠疾病有关的Hp菌株中（1型菌株），该基因位点包含cagA（cag），在40-kb DNA插入部位，很可能是水平获得和完整的染色体谷氨酸消旋酶基因。PAI旁侧直接被31bp重复。在HP 某些菌株中，cag 被一个新的插入序列（IS105）分裂成右侧片段cagI和左侧片段cagII。某些Hp菌株的cagI和 cagII分别插入染色体序列中。在少数HP菌株中cagI区核苷序列为23508 bp，cagII区3’端存在一个19 ORFs的蛋白质编码，预知绝大部分隔膜与cagE基因有关。cagE基因类似百日咳杆菌的毒素分泌基因ptlC, 传递系统要求质粒传递，包括根瘤土壤菌virB4基因。个别cag I基因转座子灭活，消除了在胃上皮细胞表达的IL-8 的感应。因此，人们相信在cag 区可编码一个新的Hp分泌系统用作毒素的测定[13]。
Hp-cagA是多数临床分离株所产生的一种亲水性蛋白和128 KDa表面暴露蛋白。cagA cagA是cagA–PAI部分的免疫耐受抗原，基因大小及其蛋白质在不同菌株中是不同的。核苷酸序列和免疫耐受抗原的表面表达以及疾病时对抗原的免疫应答与胃炎、消化性溃疡、胃腺癌的发病有关。ELISA法测定抗该蛋白重组片段的免疫反应，胃十二指肠病人为75.3%，十二指肠病人为100%。人们认为只有携带这种蛋白的细菌才与疾病有关[14]。基因分析指出cagA只存在I型菌株中，而vacA则存在I和II两个型中，活性毒素只有I型菌株产生。然而cagA和vacA表达之间的连接并不清楚，由于cagA和vacA基因位点在Hp菌株的染色体部位分开，大于300kb。此外，cagA基因灭活时对vacA表达与引导IL-8产生的能力没有因果关系。这些发现认为cagA是I型菌株毒力增加的标纪。为进一步了解I型和II型菌株之间的关系并剖析Hp的某些毒性，分析了cagA基因侧面区域。发现I型菌株含有约40 kbDNA（cag区）片段的插座子，具有典型的PAI特性。这个PAI编码是增加Hp菌株毒性唯一的毒力因子，并认为该区域的获得是Hp演变的重要结果[13]。

表1 幽门螺杆菌的毒力岛类型及其主要功能
PAI 功能 分布
Ure(尿素酶) 缓冲胃酸 所有菌株
Flag(鞭毛) 运动 所有菌株
NAP 嗜中性粒细胞活化作用 所有菌株
BabA 作为Leb 黏附素 普遍在I型菌株
LPS 低毒性 所有菌株
Lewisx,y抗原 分子模拟 某些菌株
IceA Nla III限制性核酸内切酶同族体 某些菌株
VacA 细胞毒性（两种等位基因） 所有菌株
cag PAI Ⅳ型分泌系统的31基因编码 I型菌株
CagA 免疫优势抗原（cag PAI部分） I型菌株
PicB 相当于CagE I型

二、 幽门螺杆菌毒力岛与致病性：
Hp在灵长类包括人胃腔内定居，在人胃的极端环境了存在十年，是引起慢性活动性胃
炎、胃十二指肠溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）胃窦部和基底部腺癌的重要病原体[15]。关于Hp的发病机理与毒力岛或致病岛密切相关。Hp-PAI具有多种形式：如尿素酶合成、黏附素、cagA、vacA、cag-PAI等[1，11，13，16]。在活动性胃炎病人中观察到激若反应，其表现为多核白细胞（PMNL）渗透到表面上皮细胞，其次这种感染可发展为慢性萎缩性胃炎和胃组织成熟细胞不正常之变化（胃组织变形），PMNL在上皮细胞损害的发病机理方面起重要作用，由于这些细胞在上皮细胞上释放出诸如氧化反应物和弹性蛋白酶样产物，而发挥直接细胞毒作用[17]。在Hp I型感染病人中发现IL-8水平增升，由于cag-PAI基因灭活，诱导上皮细胞IL-8分泌[13]。近来的研究证明VacA增强了上皮细胞屏障的渗透性。诱导透过上皮细胞的抵抗力（Transepithelial resistances，TER），使PMNL转移到胃内腔，引起胃炎症性变化[16]。
Hp 分为两大类，根据其是否有VacA和 CagA抗原的表达，而分为I型和II型。根据临床病人观察所见，十二指肠炎十二指肠溃疡、胃肿瘤病人感染最多的是Hp I型菌株，鼠的动物模型研究支持这些流行病学调查。Hp I型菌株的超声提取物，引起胃组织学方面的损害（上皮细胞空泡形成、黏膜腐蚀、坏疽和溃疡）Hp感染病人活检组织中发现的相类似。此外，Hp I型和II型分离菌株，两者都能在小鼠中定居，只有Hp I型菌株引起胃损害，与人体观察到的相类似。此外，Hp I型菌株能诱导上皮细胞分泌白介素8（IL-8）和中性粒细胞移动中介体[16]。Hp C-X-C趋化因子包括PMNL、IL-8等，是胃炎免疫病理学的危险因子。在Hp I型感染病人中发现（IL-8）水平升高，是由于Hp cag PAI基因灭活，诱导上皮细胞IL-8分泌[17]。总之，Hp-PAI 与胃十二指肠疾病、胃癌的发生与发展密切相关，对其发病机理尚需进一步深入观察与研究。

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研究毒力岛的技术新进展——抑制性消减杂交技术（suppressive subtractive hybridization，SSH）

SSH技术可以研究细菌病原体的致病株和非致病株或弱致病株之间的基因序列差异。这种基因序列差异可能和细菌的毒力岛有关，PIs是存在于致病株的基因序列，和细菌的致病性有关。 PIs具有一些共同的结构特征，包括非典型的鸟嘌呤+胞嘧啶的含量，侧翼区存在重复或插入序列等结构特征。
SSH技术最初由Akopyants等应用于研究幽门螺杆菌致病株的致病基因，后来相继应用于E.coli、亲水气单胞菌、B. pseudomallei、肺炎杆菌的致病株毒力相关基因。Janke等用SSH技术检测致病性E.coli菌株536和非致病株K-12 株MG1655之间的差异表达基因，发现有22个毒力株536特异性差异表达基因，其中5个和已知毒力决定簇具有同源性，可能代表部分毒力岛基因。
Reckseidler等用SSH技术检测毒力株B. pseudomallei 和无毒株B. thailandensis之间的差异表达基因，结果发现了B. pseudomallei编码荚膜多糖的糖基转移酶基因，当糖基转移酶基因被失活以后，在动物模型中B. pseudomallei和B. thailandensis的LD50值相似，说明这个糖基转移酶基因和荚膜的产生对细菌毒力很重要。Reckseidler还发现用SSH技术鉴定的消减克隆基因组具有非典型的鸟嘌呤+胞嘧啶含量，而这是PIs岛的一个特征，表明该方法对于检测细菌毒力株的特异序列十分有效。最近，Han等用SSH技术发现从胃溃疡患者和非溃疡患者分离出的幽门螺杆菌株的基因序列存在一些特异的差别，这些差别和菌株的致病性有关。