近年家蚕微粒子病检测和防治的研究进展
摘 要：本文研究了近几年国内外家蚕微粒子病（Nosema bombycis Nageli）检测和防治技术的研究进展，初步探讨了家蚕微粒子（Nosema bombycis Nageli）的检疫检验和控制作用机理，为家蚕微粒子病的可持续控制和发展蚕业生产提供科学依据。本文研究的主要结果如下：1．家蚕微粒子病的检测方法研究结果表明：家蚕微粒子检测技术的研究，从最早的肉眼鉴定发展到有显微镜检查以及以血清学检测和分子生物学检测为主的检测技术，其技术越来越先进。
2．采用不同化合物及物理方法能治疗家蚕微粒子病的发现展示了防治家蚕微粒子病的治疗前景，由此，有可能将过去单一预防微粒子病的方法发展为预防为主、防与治相结合的综合防治体系。
关键词：家蚕微粒子病 检测 防治 研究 进展
家蚕（Bombyx mori）的微粒子病是由微孢子虫寄生家蚕而引起的传染性病害，其病原为家蚕微粒子（Nosema bombycis Nageli 简称N.b）。我国将蚕微粒子病列入进境动物二类传染病、寄生虫病名录。国家标准《桑蚕原种》GB19179-2003、《桑蚕原种检验规程》GB19178-2003和农业行业标准《桑蚕一代杂交种》NY326-1997、《桑蚕一代杂交种检验规程》NY/T327-1997，均将微粒子病检疫列为重要检测项目。因该病能经胚胎传染给下一代，是蚕种唯一的检疫对象，多年来严重威胁着蚕种场和蚕业生产的发展，给蚕业生产造成了无法估量的损失。1865～1870年，法国的Pasteur创立母蛾袋检法使该病得到了控制。
随着国家“东桑西移”工程的开展，中西部蚕桑面临着一次发展的机会，同时由于蚕桑业的快速发展，也给微粒子病的危害带来可乘之机。为防患于未然，减轻家蚕微粒子病的危害，近年来加强了对微粒子病的检测方法及防治的研究工作。
1 家蚕微粒子病检测方法的研究
家蚕微粒子的检测方法主要有母蛾袋检法、血清学鉴别法和分子生物学方法三种。
1.1 母蛾袋检法
家蚕微粒子病的检测一直沿用由1670年Pasteuur创立的母蛾袋检法，后来发展了集团袋蛾和集团磨蛾镜检。目前养蚕生产上仍主要用光学显微镜检验母蛾的微孢子虫孢子来确定所产卵是否感染。
农业部行业标准《桑蚕一代杂交种检验规程》（NY/T 327-1997）规定母蛾微粒子病检疫：每一制种批（户）按每一大张一盒抽样，每盒25只母蛾。制种批（户）不足30大张时，应随机抽够30盒。判别蚕种合格与否，以制种批（户）为单位，若该批（户）蚕种的病蛾率≤1%，即无微粒子蚕种率≥78%，应判为合格蚕种，但检出有微粒子孢子的应整张（4张）淘汰；若病蛾率＞1%，即无微粒子蚕种＜78%，该批蚕种判为不合格蚕种，整批淘汰。同一批（户）分日制种时，若以批计算病蛾率＜1%，而其中一日病蛾率≥2.74%，应淘汰当日蚕种和其他检出有微粒子孢子的蚕种；若批病蛾率合格，而每日的病蛾率＜2.74%，则只需淘汰检出有微粒子孢子的蚕种。
王裕兴（2002）在对近10年来随着对家蚕微粒子病传染规律尤其是对胚种传染规律研究的深入，发现在一代杂交种中，以母蛾毒率为标准，淘汰毒率超标蚕种的做法尚存在一些不足之处。认为：母蛾毒率的代表性有四方面的不足之处，一个方面主要来自于人为因素，三个方面来自于技术因素，而这四方面的因素均是因为母蛾检验是对中间产品的检验而造成的。需要着重说明的是，作者在这篇文章中决没有否认母蛾检验技术之意，王裕兴坚信：母蛾检验实施一百多年来，对减少家蚕微粒子病的胚胎传染是功不可灭的，迄今为止仍是一种最科学、最可靠、最可行的检验技术。
时连根（1999）研究了显微镜检出蚕微粒子病的时期与微孢子虫感染剂量、感染蚕龄和所取样本的关系。结果表明，蚁蚕和2龄起蚕感染高剂量微孢子虫时，能在当龄镜检出孢子，感染低剂量微孢子虫时，可在次龄或以后镜检出孢子。从感染蚕中肠、粪便和蚕整体中镜检出孢子的时期，随微孢子虫感染剂量增大和感染蚕龄降低而提早，并且镜检出的时期从先到后分别为病蚕中肠、病蚕整体与病蚕粪便。本试验结果对于当前蚕微粒子病防治工作有积极的指导意义。
1.2 血清学方法
血清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点。应用血清学方法鉴别微粒子孢子，首先要制定针对各种孢子表面抗原的抗血清。近年来，N.ombycis、Nosema. sp、M11和Vairimorpha M12等孢子表面抗原的单克隆抗体，已由不同的研究者相继研究成功。但是，微孢子虫的血清学诊断也存在相当高的交叉反应与非特异性反应。因此，针对孢子所特有的孢子壁构造开发了几种特异性的染色法。
其原理在于一些化学荧光增亮剂可特异地快速结合到微孢子的含几丁质的孢子内壁，与微孢子结合的增亮剂在紫外光激发下，发出可见光。如徐兴耀等（1996）建立了抗N.b微孢子虫单抗细胞株，使用新构建的抗家蚕微孢子虫（N.b）的单克隆抗体，结合免疫金银染色法（IGSS）进行检测N.b，并寻找到了该细胞株单抗直接IGSS法最佳工作条件。血清学方法具有很高的灵敏度与特异性，但它需要较昂贵的荧光显微镜，只适于实验室鉴定。
1.3 分子生物学方法
应该注意的是染色法并不能鉴别出微孢子虫的种属特异性，PCR（PolymeraseChain Reaction，PCR，聚合酶链式反应）技术的发展为种属特异性诊断提供了可能。一般步骤为先选用1对微孢子虫的能用引物以诊断是否感染，继之以种属特异性的引物进行种的鉴定。随着对微孢子虫的DNA序列了解的加深，人们建立了PCR结合限制性内切酶酶解法的快速微孢子种属特异性诊断的方法。目前，这方面的研究集中于特异性N.b引物合成方面。川上于1995 年设计了引物KAI01，KAI02，VN001F和VN001R， 其中引物KAI01，KAI02只可检验Nb2Nu，Nb2NIs的DNA模板，而引物VN001F，VN001R则可检验出所有孢子DNA模板。且这两种引物都不能扩增未感染的DNA。陈秀等（1996）设计、合成了两对引物，Ⅰ和Ⅱ。引物Ⅰ可通过PCR 扩增特异性地检测N.b感染蚕，区分出非N.b孢子的其他微粒子孢子感染蚕；引物Ⅱ可用作针对一般微孢子虫类的特异引物，通过PCR扩增检测出被孢子虫类感染蚕。
韦亚东（2005）根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点，设计合成了1对PCR引物，从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个1.2kh片段，用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法，对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明，该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子，对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。
李艳红等（2006）通过制备家蚕微孢子虫总蛋白多克隆抗体，建立了多克隆抗体免疫荧光检测方法（IFA），并利用此方法特异性地检测出了体外培养细胞系（家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1）中处于不同发育阶段的家蚕微孢子虫。结果在细胞爬片中可观察到呈较强的黄绿色荧光微孢子虫以及在BmE-SWU1细胞中的寄生分布情况，还可看到孢子极丝的弹出等现象。IFA检测方法鉴别诊断家蚕微粒子虫具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等特点，可以广泛应用于微孢子虫形态学、流行病学以及蛋白质的定位等研究领域。
Yoshinori Hatakeyam（2003）利用几种PCR引物的混合物，评估多引物PCR是否可以实际应用于同时感染几种能导致家蚕微孢子病的微孢子虫的早期检测。从感染了家蚕微粒子病原虫（BrnNb）的蚕卵中抽提的基因组DNA，并以此作为DNA模板，用多引物PCR扩增这种特异的DNA序列。此外，从感染了BmNb的家蚕中获得的基因组DNA作为DNA模板，也获得了相同的结果。这些发现表明用本研究设计的多引物PCR对蚕卵微孢子病的检查具有实用价值。
潘沈元等（2003）指出，在蚕种生产和家蚕微粒子病母蛾抽样检查过程中，部分蚕种生产者和蚕种检验者由于对抽样检查的原理和现行的抽样检查方案不甚理解而擅自调整抽样方案的现象时有发生。为此，通过介绍计数抽样检查的接收概率、抽样特征曲线和两类风险，对蚕种生产上减少袋蛾数量，调整抽样方案和以样本毒率判断蚕种是否合格等错误观点做了分析和讨论，指出了这些做法的危险性。
2 家蚕微粒子病的防治
2.1 家蚕微粒子病防治回顾
自从Pasteur查明家蚕微粒子病是由病原经蚕的胚种传染和经口食下传染引起以来，镜检母蛾，淘汰病卵的杜绝胚种传染及消毒防病以防止食下传染一直是世界各养蚕国家沿用的预防微粒子病的主要方法。在实际生产中用清洗、药剂消毒等手段来清除养蚕环境中蚕微粒子病发生的传染源，又是蚕期防止食下传染微粒子病的根本。而消毒前，首先应该集中收集环境中的病蚕、蛹、蛾尸体及其尸斑并集中烧毁，然后再进行清洗及消毒，这对于最大限度地杀灭微孢子虫孢子，是有利的。
2.2 家蚕微粒子病药剂防治的研究进展
对于该病的治疗，近年来取得突破性进展。刘仕贤等（1993）在对多菌灵、苯来特、托布津、7313的药效作了详细的研究后开发了国内第一种家蚕微粒子病治疗药剂“防微灵”，可有效地治疗蚕期食下病原孢子引起的微粒子病。沈中元等（1997）又开发了含50%有效成分丙硫苯咪唑的可湿性粉剂“克微一号”，不仅对食下传染的病蚕有很好的治疗效果，并对经卵传染的微粒子病同样具有治疗效果。王裕兴等（1999）也开发了对该病有特效的“原虫净”。
此外，徐兴耀等（1996）采用干热空气对不同品系家蚕进行热处理表明蚕卵产后常温保护12小时，46℃热处理60分钟或47℃热处理40分钟，不影响实用孵化率，而对微粒子病胚种传染的防治效果达到93%～100%。
王建芳等（2004）利用化学药剂KW1添食对家蚕微粒子病进行预防和治疗试验，结果表明：1600mg／L以上浓度每24小时添食一次可减少发病率，有效控制微粒子病的发生和发展，且对蚕体生长发育及结茧率等无明显影响。
骆承军（2001）研究结果表明，灭微灵对家蚕微粒子孢子有强烈的杀灭作用， 是一种高教、安全、稳定、低腐蚀的新型桑叶叶面消毒剂。用浓度50mg/L的灭微灵处理2～5 min。对微粒子孢子可达到理想的杀灭效果，比目前常规消毒剂漂粉精对微孢子临界杀灭浓度降低40倍以上。试验浓度的灭微灵对家蚕生理无不良影响。钱永华等（2001）通过对目前生产中常用的三种家蚕微粒子病化学治疗药物防微灵、脓微灵和原虫净以不同的用药方式进行家蚕微粒子病治疗试验和比较研究，结果表明：连续不间断添食药物对家蚕微粒子病具有较好的治疗效果；以防微灵的疗效为最好，脓微灵除对家蚕微粒子病具有一定治疗效果外，还表现出对微孢子具有强烈的体外杀灭作用。
吴海平等（2000）试验结果表明，微粒子病防治药剂ID对家蚕微粒子孢子的临界杀灭浓度为18.5 mg/kg，而以185 mg/kg（100倍稀释液）浓度的ID用于桑叶叶面消毒，对家蚕生理也不会产生不良影响，而且，在某些经济指标上，要优于实用浓度的漂粉精。
这些化合物及物理方法能治疗家蚕微粒子病的发现展示了本病的治疗前景，由此，有可能将过去单一预防微粒子病的方法发展为预防为主、防与治相结合的综合防治体系。
2.3 家蚕微粒子病综合防治技术体系的完善和发展
廖森泰等（2002）提出了“家蚕微粒子病综合防治技术体系。”该技术体系的核心内容是五大措施：一是实施蚕种母蛾集中集团磨蛾镜检、杜绝胚种传染；二是原蚕区防治微粒子病设施规范化，提高防治质量；三是净化蚕种场和原蚕区，防止食下传染；四是普通种实行分户制种，跟踪病户重点防范；五是推行以预防为主，防治结合措施。该技术体系在广东全面推广，取得了非常显著的效果，在“八五”期间，广东省家蚕微粒子病得到了有效控制，一举摘掉了微粒子病重灾区的帽子，受到农业部的肯定和重视，还向全国推广。他还指出，家蚕微粒子病防治技术体系是一个动态发展的体系，应该根据形势的变化而不断完善提高。展望今后的工作，除了巩固原有的技术措施外，重点应放在加强野外昆虫微孢子虫交叉感染的防治和推广应用低腐蚀性养蚕消毒剂，切实提高消毒防病效果。除此之外，对养蚕过程中产生的副产物——蚕沙和桑枝进行处理，切断病原积累和循环的途径也是十分重要的。
景亚明（2003）明确野外害虫、虫尸、虫粪及其它排泄物是使家蚕发生病害的一个极其重要的传染源，防止野外鳞翅目昆虫与家蚕微粒子病交叉感染，是降低家蚕微粒子病发生，提高蚕种质量的关键。通过江苏省东台市蚕种场近几年来的生产实践及微毒检验实绩证明，只要把握住野外鳞翅昆虫与家蚕微毒交叉传染的规律，采用综合防治的手段杀灭野外昆虫，最大限度地减轻其对桑叶的污染并切实抓好桑园的叶面消毒工作，是能够很好地防止鳞目昆虫与家蚕微粒子病的交叉传染。
3 讨论
3.1成品卵微粒子病检疫与母蛾微粒子病检疫的关系
母蛾微粒子病检疫抽样率相对较高，但由于是间接检验，样本的真实性可能出现问题；成品卵微粒子病检疫是直接检验，样本真实性相对可靠，但蚕卵样本量占该批蚕卵总量的百分比相对较低，样本代表性亦相对较低。
在多年的实际检疫操作过程中，确实存在母蛾检疫合格、成品检疫不合格，母蛾检疫不合格、成品检疫合格等情况。其中：母蛾检疫合格、成品检疫不合格的蚕种，母蛾样本的真实性（或样本处置）可能出现问题；母蛾检疫不合格、成品检疫合格的蚕种，则是由于样本的代表性可能出现问题。此外，传统的显微镜检、经验判定的检疫技术亦可能造成的母蛾检疫与成品检疫的差异。
因此，为了使微粒子病检疫结果准确可靠，保证使用蚕种的微粒子病疫病指标符合标准的规定，应坚持成品卵微粒子病检疫与母蛾微粒子病检疫并重。
3.2 蚕种微粒子病检疫与蚕种质量检验的关系
蚕微粒子病是有害生物——微粒子原虫寄生家蚕后感染发病。蚕种微粒子病检疫是对蚕种是否感染微粒子原虫及感染量（即疫病参数）是否引发蚕病造成养蚕损失而进行的检测、判定。蚕种质量检验，是对包括良卵率、孵化率、杂交率、装盒卵量及包装质量等参数（非疫病参数）是否符合标准规定的指标而进行的检验。蚕种微粒子病检疫与蚕种质量检验二者即有联系（均为反映蚕种质量状况），又有差异（一个是反映疫病参数，另一个是反映非疫病参数）。
在蚕种生产过程中，母蛾微粒子病检疫结束后，检疫合格蚕种才能并批浸酸或浴消及比选整理装盒，才能够进行成品卵微粒子病检疫，蚕发育到不同阶段才能进行相关非疫病参数的检验。按照现行标准，所有参数检测结束后才能够出具检验报告，则检验结果不能及时指导生产实际。
因此，在制定蚕种的质量标准和检验规程时，应充分考虑蚕种的特殊性。建议今后在修订相关标准时，将蚕种疫病检疫与非疫病检验分别制定参数指标、分别检验（检疫）、分别出具检验报告。
4 结论
家蚕微粒子病检测技术的研究进展，保证了使用蚕种质量，促进了蚕茧单产效益提高，效果显著。家蚕微粒子病检测技术的研究进展工作应当坚持长期全面开展。建议对家蚕微粒子病相关质量标准和检验规程做适当修订，对微孢子虫检测判定的实用方法进行深入研究，完善检测技术，促进蚕业稳定协调健康发展。
有关家蚕微粒子病化学治疗的研究很早就有人作过尝试。Katznelson和Jamieson发现烟曲霉素和茴香霉素对蜜蜂微粒子原虫Nosema apis的增殖有抑制作用，进而Hsiao和Hsho发现苯来特对紫花苜莺象鼻虫微粒子原虫Nosema sp．的增殖有显著抑制效果以后，众多学者开展了多种化学药物对家蚕微粒子病治疗的研究，先后利用几十种化学药剂对家蚕微粒子病的治疗效果进行研究、对比，认为虽有一定疗效，但大多不够理想。国内目前用于生产中的化学涪疗药物主要有防微灵、原虫净和脓微灵三种，就生产中的实际治疗效果而言各地相差较远，说法不一。
目前，对家蚕微粒子病的防治可以从三个方向努力。首先是预防。主要是防止微粒子病对家蚕的感染。常以补正检查、预知检查、母蛾检查、环境及桑叶消毒等技术措施为有效手段，并已取得了系统有用的研究成果，广泛运用于家蚕繁育的全过程。第二为治疗。即主要是对家蚕添食抗微药品，如防微灵、克微宝等，以此来控制家蚕微粒子在蚕体的增殖。第三为育种防治。即用生物工程技术将抗微粒子病基因导人经济性状好的蚕品种内，培养出在感染微粒子病毒的任何浓度下绝对不会发生家蚕微粒子病的蚕种，不过该研究还只是一种设想。
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