组织芯片在microRNA检测中的应用

yujian623

MicroRNA最近成为研究的热点，它参与生长发育和肿瘤发生的许多环节。常用的研究microRNA的方法是芯片的方法和Northern杂交的方法。由于MicroRNA的含量相对较低，因此两种方法对总RNA的含量要求较高。例如northern检测MicroRNA，总RNA的量要超过40ug才能检测到。对于一些珍贵的标本，检测microRNA就存在一些困难。例如生殖系统的标本。
组织芯片的出现解决了这一问题，使得microRNA的检测变得简单易行。

组织芯片是新兴的生物高科技技术。它是将数十个甚至数千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列。组织芯片为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。它克服了传统病理学方法和基因芯片技术中存在的某些缺陷，使人类可有效利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系，对于疾病的分子诊断，预后指标和治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选等方面均有十分重要的实用价值。

简单的说，组织芯片就是在一张载玻片上提供数十个标本的信息，便于检测。由于MicroRNA相对比较稳定，根据我们的经验，一般不容易降解。同时数十个标本放在一起检测，也避免了样品处理时造成的误差。一个黄豆粒大小的标本大概可以做成30张芯片。

下面是组织芯片检测的步骤（我们实验室改进后的实验方法）
1、脱蜡  二甲苯  RT（室温）  10min×3次
2、水化  乙醇100％  RT  3min
  乙醇100％  RT  3min
  乙醇95％  RT  3min
  乙醇75％  RT  3min
  乙醇50％  RT  3min
  PBS  RT  3min
3、变性  HCL（0.2M）  RT  20min
  PBS  RT  3min
4、去蛋白  蛋白酶K（100ug/ml）  37度  20min
  PBS  RT  3min
  PBS  RT  3min
5、后固定  4%PFA/PBS  RT  5min
  PBS  RT  3min
  PBS  RT  3min
6、脱水  乙醇75％  RT  3min
  乙醇95％  RT  3min
  乙醇100％  RT  3min
  乙醇100％  RT  3min
7、干燥  通风橱  RT  1h
8、预杂交  杂交液  50度  1h
9、杂交  湿盒，探针杂交  50度  18h
10、洗片  50%甲酰胺
   4×SSC   37度   30min
  2×SSC  37度  15min×2
  0.1×SSC  37度  15min
  PBS  RT  3min
11、封闭  Washing buffer  RT  2min
  Blocking buffer  RT  30min
12、免疫  Anti-GIG-AP(1:250
     Blocking buffer)  4度  过夜
  Washing buffer  RT  15min×2
  Detection Buffer  RT  2min
13、显色  NBT/BCIP/ Detection Buffer
    6.6/3.3/1000  时间和温度具体掌握

14、蒸馏水洗      
15、水性封片