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双向电泳
蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
2 蛋白质浓度测定
按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。
说实话，好象Bradford法不太好做
2.3.1 电聚焦（IEF）
2.3.1.1 玻管准备
干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。
电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡 至少 1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3次水;后用2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小时，中间换3，4次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.
2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦
灌IEF的配方
为3.09克尿素
1.125 ml 10%NP-40
1.125ml 水
0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62)
0.15 ml Am 3.5-10
0.375ml Am 5-7
8卫生 10%AP
1.8卫生 TEMED
用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH液，下槽（正极）为25m mol/L H3PO4。按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is 跑第一向一定要在保持在37度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.
2.3.1.3 电泳后的凝条处理
电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。
取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm的小段，各自浸入含1.3ml抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。
漫漫挤,管子,200卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来, 注射器顶在胸前
把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿！还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF胶条一样的,带,可能先在12%的TCA里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5次水,每次用不同的小平皿。
注意到下级液 磷酸 部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵!
对要进行第二向SDS-PAGE的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！
做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m mol/L Tris，192m mol/L甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。
银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。
染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20度左右,(这个温度我也没控制的)
100%TCA
领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml水就成100%TCA了
10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
100%TCA 10ml
2-ME 0.07ml
丙酮 90ml
0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
2-ME 0.07ml
丙酮 100ml
0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)
50ml
Urea 28.5g
NP-40 1ml
Ampholine 5~7 2.0ml
3.5~10 0.5ml
2-ME 2.5ml
注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存
注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml
(2002-10-30 18:39:37)
UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)
25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
2-ME
Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml
Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2枪，4枪)
2-ME可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！ |
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发表于 2007-7-2 08:52:33